论文部分内容阅读
姜黄素作为姜黄色素中最主要的二酮类有色物质，目前是世界上销量最大的天然食用色素之一，除此之外，它还在世界范围内被用作香料，食品防腐剂等。但姜黄素在提取及应用中存在水溶性差和光热不稳定等缺陷。天然低共熔溶剂(natural deep eutectic solvents, NADESs)是一种新型的绿色溶剂，是由两种或多种天然产物按一定摩尔比加热制备而成的低共熔混合物。与传统有机试剂相比，具有价格低廉、不易挥发、低毒或无毒、良好的生物相容性且能溶解多种水不溶性化合物等优点。本文利用NADESs对姜黄素类化合物进行提取分离，产物纯化后，利用核磁共振(NMR)对其结构进行鉴定，并研究了姜黄素的光、热稳定性。其次，从脱脂大豆粉中提取大豆7S、11S蛋白，作为大豆分离蛋白的主要组分，大豆7S、11S蛋白具备许多的功能特性。采用红外(FT-IR)、ANS荧光探针法、Ellman试剂法，粒度分析仪和质构仪对其二级结构，巯基，表面疏水性，粒径，乳化性，凝胶性进行了系统的研究。最后，将姜黄素与实验室自提的大豆7S、11S蛋白结合，优化结合条件，并研究了结合后姜黄素的光、热稳定性以及姜黄素与蛋白质的相互作用机制。具体内容如下:
1、NADESs制备、姜黄素类化合物的提取及稳定性研究。本文制备了六种NADESs，并测定了其物理化学性质。结果表明，25℃剪切速率为0.1[1/s]的条件下，粘度范围为0.02～1309.5Pa·s;极性范围为49.90～55.41kcal/mol;pH值范围在6.45～7.50之间，理化性质的差异主要受组成成分的影响。此外，姜黄素在NADESs中有良好的溶解度，与水相比提高了13～194倍。用超声辅助NADESs萃取姜黄中主要的三种姜黄素类化合物，利用HPLC检测，产物单一且分离度好。因此，NADESs可以作为萃取剂用于姜黄素类化合物的提取。NADESs的种类对姜黄素类化合物的提取量有较大的影响，其中1，2-丙二醇和丙氨酸形成的NADESsPGAla为萃取剂时，姜黄素类化合物萃取量最大，为1.52mg/g。通过低场核磁共振(LF-NMR)对不同含水量的PGAla进行测定，选择含水量20％(v/v)的PGAla作为萃取剂，优化后的萃取最适条件为:50mg姜黄溶于1mL含水量20％(v/v)的PGAla中，80℃下超声辅助萃取120min，姜黄素类化合物的提取量为15.5mg/g。姜黄素在NADESs中表现出较好的热稳定性。经分离纯化后，NMR鉴定其结构为三种姜黄素类化合物，分别为姜黄素(Cur)，去甲氧基姜黄素(DMC)及双去甲氧基姜黄素(BDMC)。
2、大豆7S、11S蛋白的制备及性质表征。大豆7S、11S蛋白是大豆分离蛋白中最主要的成分，约占80％，本研究中以实验室自提大豆7S、11S蛋白作为研究对象，发现在水溶液中大豆7S蛋白的解折叠程度高于大豆11S蛋白。用乳化活性(EAI)和乳化稳定性(ESI)来评价大豆蛋白乳化性，研究了温度，pH值，Na+浓度和加热时间对蛋白乳化性的影响。结果表明，加热温度为50～60℃有利于蛋白质结构的展开，但是温度大于70℃会导致分子振动增强，不利于乳化稳定性;远离蛋白质的等电点有利于蛋白的乳化;Na+浓度对大豆7S蛋白的乳化性影响小，大于1.0％的Na+浓度对大豆11S蛋白的影响较大;加热时间在40min左右有利于蛋白的乳化性。研究了蛋白质浓度，加热温度，pH值和Na+浓度，对蛋白凝胶硬度，胶粘性和弹性的影响，结果表明，蛋白质浓度在7％～9％(w/v)时不能形成凝胶;温度的升高更有利于大豆11S蛋白凝胶的形成;远离等电点有利于形成透明且富有弹性的凝胶;Na+浓度在0.2％(w/v)时，大豆7S和11S蛋白均能形成较好的凝胶，而随着Na+的增大，凝胶质构特性逐渐降低。大豆7S蛋白形成凝胶的最优条件为:蛋白质浓度12％，温度90℃，pH为6～8，Na+浓度为0.2％。大豆11S蛋白形成凝胶的最优条件为:蛋白质浓度12％，温度95℃，pH为8～9，Na+浓度为0.2％。
3、姜黄素与大豆7S、11S蛋白的结合、稳定性及相关机理研究。通过对姜黄素-蛋白不同配比，不同含醇量，不同搅拌温度的研究，确定出姜黄素与不同蛋白结合的最优条件:姜黄素添加量为50mg与0.25g大豆7S蛋白溶于含醇量20％(v/v)的水溶液中，搅拌温度20℃，结合量为3.7mg/g;姜黄素添加量为50mg与0.25g大豆11S蛋白溶于水溶液中，搅拌温度20℃，结合量为1.2mg/g。在NADESs中，光稳定性与未结合的姜黄素(最高84％)相比提高至96％左右，热稳定性与未结合的姜黄素(最高86％)相比，提高至95％左右，说明姜黄素与大豆蛋白的结合，能在一定程度上提高姜黄素的稳定性。荧光猝灭主要分为静态猝灭和动态猝灭，可以用来判断大分子与小分子的相互作用机制。通过Stern-Volmer方程的建立，判断出姜黄素引起大豆7S、11S蛋白的猝灭类型为静态猝灭;由log[Q]-log[(F0-F)/F]函数曲线图得到姜黄素与大豆7S和11S蛋白的结合位点数分别为0.51，0.64，推测姜黄素与蛋白质生成了摩尔比近为1∶2的不发光的复合物。此外，FT-IR光谱的结果说明姜黄素引起了蛋白质部分二级结构的展开与折叠。
本研究通过NADESs提高姜黄素的溶解性，与蛋白质结合提高姜黄素的稳定性，为水不溶性生物活性物质的利用提供了一定的理论基础。
1、NADESs制备、姜黄素类化合物的提取及稳定性研究。本文制备了六种NADESs，并测定了其物理化学性质。结果表明，25℃剪切速率为0.1[1/s]的条件下，粘度范围为0.02～1309.5Pa·s;极性范围为49.90～55.41kcal/mol;pH值范围在6.45～7.50之间，理化性质的差异主要受组成成分的影响。此外，姜黄素在NADESs中有良好的溶解度，与水相比提高了13～194倍。用超声辅助NADESs萃取姜黄中主要的三种姜黄素类化合物，利用HPLC检测，产物单一且分离度好。因此，NADESs可以作为萃取剂用于姜黄素类化合物的提取。NADESs的种类对姜黄素类化合物的提取量有较大的影响，其中1，2-丙二醇和丙氨酸形成的NADESsPGAla为萃取剂时，姜黄素类化合物萃取量最大，为1.52mg/g。通过低场核磁共振(LF-NMR)对不同含水量的PGAla进行测定，选择含水量20％(v/v)的PGAla作为萃取剂，优化后的萃取最适条件为:50mg姜黄溶于1mL含水量20％(v/v)的PGAla中，80℃下超声辅助萃取120min，姜黄素类化合物的提取量为15.5mg/g。姜黄素在NADESs中表现出较好的热稳定性。经分离纯化后，NMR鉴定其结构为三种姜黄素类化合物，分别为姜黄素(Cur)，去甲氧基姜黄素(DMC)及双去甲氧基姜黄素(BDMC)。
2、大豆7S、11S蛋白的制备及性质表征。大豆7S、11S蛋白是大豆分离蛋白中最主要的成分，约占80％，本研究中以实验室自提大豆7S、11S蛋白作为研究对象，发现在水溶液中大豆7S蛋白的解折叠程度高于大豆11S蛋白。用乳化活性(EAI)和乳化稳定性(ESI)来评价大豆蛋白乳化性，研究了温度，pH值，Na+浓度和加热时间对蛋白乳化性的影响。结果表明，加热温度为50～60℃有利于蛋白质结构的展开，但是温度大于70℃会导致分子振动增强，不利于乳化稳定性;远离蛋白质的等电点有利于蛋白的乳化;Na+浓度对大豆7S蛋白的乳化性影响小，大于1.0％的Na+浓度对大豆11S蛋白的影响较大;加热时间在40min左右有利于蛋白的乳化性。研究了蛋白质浓度，加热温度，pH值和Na+浓度，对蛋白凝胶硬度，胶粘性和弹性的影响，结果表明，蛋白质浓度在7％～9％(w/v)时不能形成凝胶;温度的升高更有利于大豆11S蛋白凝胶的形成;远离等电点有利于形成透明且富有弹性的凝胶;Na+浓度在0.2％(w/v)时，大豆7S和11S蛋白均能形成较好的凝胶，而随着Na+的增大，凝胶质构特性逐渐降低。大豆7S蛋白形成凝胶的最优条件为:蛋白质浓度12％，温度90℃，pH为6～8，Na+浓度为0.2％。大豆11S蛋白形成凝胶的最优条件为:蛋白质浓度12％，温度95℃，pH为8～9，Na+浓度为0.2％。
3、姜黄素与大豆7S、11S蛋白的结合、稳定性及相关机理研究。通过对姜黄素-蛋白不同配比，不同含醇量，不同搅拌温度的研究，确定出姜黄素与不同蛋白结合的最优条件:姜黄素添加量为50mg与0.25g大豆7S蛋白溶于含醇量20％(v/v)的水溶液中，搅拌温度20℃，结合量为3.7mg/g;姜黄素添加量为50mg与0.25g大豆11S蛋白溶于水溶液中，搅拌温度20℃，结合量为1.2mg/g。在NADESs中，光稳定性与未结合的姜黄素(最高84％)相比提高至96％左右，热稳定性与未结合的姜黄素(最高86％)相比，提高至95％左右，说明姜黄素与大豆蛋白的结合，能在一定程度上提高姜黄素的稳定性。荧光猝灭主要分为静态猝灭和动态猝灭，可以用来判断大分子与小分子的相互作用机制。通过Stern-Volmer方程的建立，判断出姜黄素引起大豆7S、11S蛋白的猝灭类型为静态猝灭;由log[Q]-log[(F0-F)/F]函数曲线图得到姜黄素与大豆7S和11S蛋白的结合位点数分别为0.51，0.64，推测姜黄素与蛋白质生成了摩尔比近为1∶2的不发光的复合物。此外，FT-IR光谱的结果说明姜黄素引起了蛋白质部分二级结构的展开与折叠。
本研究通过NADESs提高姜黄素的溶解性，与蛋白质结合提高姜黄素的稳定性，为水不溶性生物活性物质的利用提供了一定的理论基础。