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纳豆激酶(nattokinase，NK)来源于纳豆，是一种丝氨酸蛋白酶，具有良好的溶栓性能，安全无副作用，有着很好的临床用药应用前景。本实验室保藏的一株产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)XZI125，为将其产酶能力提高到工业发酵生产菌株的要求，需要进一步提高菌株的产酶性能。本研究采用诱变育种和基因组改组的方法获得高产、稳定遗传的突变菌株，并通过制备磁性壳聚糖亲和吸附剂，实现了纳豆激酶从发酵粗酶液中的一步式分离纯化。
1.通过对枯草茅孢杆菌XZI125进行紫外诱变和常温室压等离子体诱变(ARTP)诱变，选育高产纳豆激酶的突变菌株。通过计算致死率和正突变率，确定紫外诱变最佳条件:功率20W，照射距离25cm，诱变时间5min;ARTP诱变的最佳条件:功率为100W，气流量10SLM，载片与气流端口距离为2mm，处理时间90s。通过2种诱变处理，并结合抗生素抗性筛选方法，共获得4株NK含量较原始菌株提高的突变菌株，平均提高24.3％。
2.对枯草芽孢杆菌XZI125原生质体制备、再生、灭活及融合条件进行优化，并利用基因组改组技术(genome shuffling)选育NK高产菌株。结果表明，原生质体制备最佳条件为:酶浓度1mg/mL，酶解时间30min，菌体培养时间6h;紫外灭活最佳条件为:功率20W，照射距离25cm，照射时间8min;热灭活最佳条件为:100℃，水浴50s。原生质体融合最佳条件为:40％PEG6000，37℃水浴融合10min。在上述原生质体处理条件下，通过对前期诱变筛选到的4株NK高产菌株进行基因组改组，共得到3株高产菌株G91、2G34、2G42，纳豆激酶酶活力分别达到3257IU/mL，3277IU/mL，3304IU/mL，与原始菌株(2490 IU/mL)相比酶活力分别提高了30.8％，31.6％,32.7％。
3.采用化学共沉淀法制备了磁性Fe3O4纳米粒子，乳化交联法制备了磁性壳聚糖微球(MCTS)，经环氧氟丙烷活化，以6-氨基己酸为间隔臂偶联配基对氨基苯甲脒，制得磁性壳聚糖微球，用于纳豆激酶粗酶液的分离纯化，并对其进行表征，研究其对纳豆激酶的吸附和解吸附动力学。通过优化磁性壳聚糖的制备条件，选取合适的配基接枝浓度，使得吸附剂在10min内即可达到纳豆激酶的吸附平衡，20min内即完成酶的解吸附，酶活回收率为62％，纯化倍数为10.6，纳豆激酶纯度经电泳分析为一条带。
1.通过对枯草茅孢杆菌XZI125进行紫外诱变和常温室压等离子体诱变(ARTP)诱变，选育高产纳豆激酶的突变菌株。通过计算致死率和正突变率，确定紫外诱变最佳条件:功率20W，照射距离25cm，诱变时间5min;ARTP诱变的最佳条件:功率为100W，气流量10SLM，载片与气流端口距离为2mm，处理时间90s。通过2种诱变处理，并结合抗生素抗性筛选方法，共获得4株NK含量较原始菌株提高的突变菌株，平均提高24.3％。
2.对枯草芽孢杆菌XZI125原生质体制备、再生、灭活及融合条件进行优化，并利用基因组改组技术(genome shuffling)选育NK高产菌株。结果表明，原生质体制备最佳条件为:酶浓度1mg/mL，酶解时间30min，菌体培养时间6h;紫外灭活最佳条件为:功率20W，照射距离25cm，照射时间8min;热灭活最佳条件为:100℃，水浴50s。原生质体融合最佳条件为:40％PEG6000，37℃水浴融合10min。在上述原生质体处理条件下，通过对前期诱变筛选到的4株NK高产菌株进行基因组改组，共得到3株高产菌株G91、2G34、2G42，纳豆激酶酶活力分别达到3257IU/mL，3277IU/mL，3304IU/mL，与原始菌株(2490 IU/mL)相比酶活力分别提高了30.8％，31.6％,32.7％。
3.采用化学共沉淀法制备了磁性Fe3O4纳米粒子，乳化交联法制备了磁性壳聚糖微球(MCTS)，经环氧氟丙烷活化，以6-氨基己酸为间隔臂偶联配基对氨基苯甲脒，制得磁性壳聚糖微球，用于纳豆激酶粗酶液的分离纯化，并对其进行表征，研究其对纳豆激酶的吸附和解吸附动力学。通过优化磁性壳聚糖的制备条件，选取合适的配基接枝浓度，使得吸附剂在10min内即可达到纳豆激酶的吸附平衡，20min内即完成酶的解吸附，酶活回收率为62％，纯化倍数为10.6，纳豆激酶纯度经电泳分析为一条带。