论文部分内容阅读
由于极强的菌膜形成能力，荧光假单胞菌能够粘附在加工器械表面，带来严重的交叉污染，目前已成为肉及肉制品加工过程中的优势腐败菌。腐败菌污染食品的途径有很多，生物菌膜已被证明是交叉污染的主要传播根源之一，除了粘附于加工接触表面的粘附态菌膜，由于环境的改变脱落下来的分散态菌膜同样具有极大的腐败和污染潜能，因此加强对粘附态和分散态菌膜的控制是食品安全的关键。酸性电解水(Acidic electrolyzed water, AEW)是一种新型消毒剂，具有低有效氯浓度(20-80 mg/L)、高氧化还原电位(＞+1000mV)和低pH(＜3.0)特性，有效杀菌的同时具有制备成本低、安全、绿色环保等优点。研究食品加工环境条件下荧光假单胞菌粘附态生物菌膜和分散态生物菌膜面对消毒剂AEW处理时的耐受响应，可以为系统的揭示生物菌膜对外源消毒剂的耐受响应机制提供重要依据，也可为研发生物菌膜针对性防控技术提供理论基础。
本论文以内源性荧光假单胞菌为研究对象，不锈钢表面为粘附表面，以AEW作为处理方式，以荧光假单胞菌浮游菌作为对照组，其粘附态菌膜和分散态菌膜为处理组，首先探究三种状态菌对AEW的耐受规律和菌体的存活能力，在此基础上，探究处理前后菌体形态特征、细胞膜特性、质子驱动及胞外聚合物(Extracellular polymeric substances，EPS)的变化，并利用蛋白组学技术深度挖掘荧光假单胞菌三种状态菌在耐受消毒剂处理过程中的差异蛋白，以揭示荧光假单胞菌在消毒剂处理过程中的耐受响应。具体研究内容和结果如下:
1.不同状态荧光假单胞茸对酸性电解水的耐受差异
以分离自肉品器械表面的荧光假单胞菌为研究对象，以食品级304不锈钢材质为接触面，分别以浮游菌作为对照组，以分散态和粘附态菌膜为处理组，采用新型消毒剂AEW作为处理方式，研究三种形态菌在AEW处理下的致死规律、损伤比例，并借助扫描电镜(SEM)和粒度分布分析探究菌体的形态特征变化。试验结果表明:AEW对荧光假单胞菌具有较好的控制效果，杀菌效果随浓度增加而加强，可有效控制荧光假单胞菌浮游菌，但对两种菌膜效果减弱，粘附态菌膜表现出最强的存活和耐受;对杀菌曲线采用Weibull模型进行拟合，拟合参数中R2＞0.90，表明该模型对AEW处理荧光假单胞菌的杀菌动力学曲线拟合良好，尺度参数与形状参数的变化趋势与处理的情况一致;处理后菌体形态学特征显著改变，浮游菌菌体出现凹陷、扭曲，失去原有形态，而菌膜细胞略微褶皱，无明显变化，但细胞表面的EPS显著减少;菌膜粒径呈现双峰分布，浮游菌呈单峰分布，处理后菌体粒径均显著降低。
2.酸性电解水处理下耐受菌体特性及胞外聚合物研究
根据第一章的实验结果，取20和60mg/L的AEW对分散态菌膜和粘附态菌膜处理10min，探究处理前后菌体细胞膜特性、质子驱动力的变化，并结合化学分析方法以及ATR-FTIR和Raman光谱技术的原位无损分析能力共同探究处理前后菌体EPS的组分和含量的变化。试验结果表明:AEW的处理破坏菌体细胞膜的完整性，浓度的升高具有显著的降低作用;受损的细胞膜会导致胞内物质的外泄，胞内结构暴露于外部环境中，进而使得大量杀菌剂有效成分进入细胞，引起胞内酸化，降低膜电位、胞内ATP和胞内pH，干扰正常的胞内代谢过程;AEW处理后EPS中蛋白和总糖含量显著降低，而EPS的反向添加对AEW的理化特性起显著的负面影响，表明EPS对AEW处理起阻碍作用，消耗其有效成分，降低杀菌效果，更多的EPS分泌是粘附菌膜更强耐受的原因之一;ATR-FTIR和Raman的结果显示，粘附态菌膜的光谱图与分散态菌膜和浮游菌具有显著差异，粘附态菌膜具有更为丰富的蛋白、多糖类谱峰，AEW处理后一些特征峰的消失和弱化验证了化学分析过程中EPS的消耗。
3.荧光假单胞菌耐受酸性电解水机制的蛋白质组学研究
利用蛋白组学技术从生物信息学角度挖掘三种状态菌在AEW处理下的耐受差异表达蛋白(Differentially expressed proteins，DEPs)。研究结果表明:AEW处理下，共有117个DEPs与粘附态菌膜耐受有关，166个DEPs与分散态菌膜耐受相关;浮游菌对照与分散态菌膜对照及粘附态菌膜对照各有577和484个DEPs表达。差异蛋白GO注释结果表明，DEPs在生物学过程方面主要参与细胞代谢、细胞组分组织及生物起源、单一生物过程;分子功能方面主要与结合、转运活性有关;细胞成分方面，主要与细胞组分、高分子复合体等有关。Pathway分析结果显示，两种菌膜经AEW处理前后的DEPs均被富集到耐受相关的通路中，主要位于双组分系统、ABC转运蛋白、核糖体和抗生素生物合成代谢通路中，参与消毒剂的外排以及菌体泳动相关的趋化性等功能以提高菌体的存活能力;而两种状态菌膜之间及每种菌膜与浮游菌之间的DEPs主要被富集到次级代谢物的生物合成、微生物在不同环境中的代谢和ABC转运蛋白等通路中，参与菌体移动、生长繁殖和菌膜形成等功能。
本论文以内源性荧光假单胞菌为研究对象，不锈钢表面为粘附表面，以AEW作为处理方式，以荧光假单胞菌浮游菌作为对照组，其粘附态菌膜和分散态菌膜为处理组，首先探究三种状态菌对AEW的耐受规律和菌体的存活能力，在此基础上，探究处理前后菌体形态特征、细胞膜特性、质子驱动及胞外聚合物(Extracellular polymeric substances，EPS)的变化，并利用蛋白组学技术深度挖掘荧光假单胞菌三种状态菌在耐受消毒剂处理过程中的差异蛋白，以揭示荧光假单胞菌在消毒剂处理过程中的耐受响应。具体研究内容和结果如下:
1.不同状态荧光假单胞茸对酸性电解水的耐受差异
以分离自肉品器械表面的荧光假单胞菌为研究对象，以食品级304不锈钢材质为接触面，分别以浮游菌作为对照组，以分散态和粘附态菌膜为处理组，采用新型消毒剂AEW作为处理方式，研究三种形态菌在AEW处理下的致死规律、损伤比例，并借助扫描电镜(SEM)和粒度分布分析探究菌体的形态特征变化。试验结果表明:AEW对荧光假单胞菌具有较好的控制效果，杀菌效果随浓度增加而加强，可有效控制荧光假单胞菌浮游菌，但对两种菌膜效果减弱，粘附态菌膜表现出最强的存活和耐受;对杀菌曲线采用Weibull模型进行拟合，拟合参数中R2＞0.90，表明该模型对AEW处理荧光假单胞菌的杀菌动力学曲线拟合良好，尺度参数与形状参数的变化趋势与处理的情况一致;处理后菌体形态学特征显著改变，浮游菌菌体出现凹陷、扭曲，失去原有形态，而菌膜细胞略微褶皱，无明显变化，但细胞表面的EPS显著减少;菌膜粒径呈现双峰分布，浮游菌呈单峰分布，处理后菌体粒径均显著降低。
2.酸性电解水处理下耐受菌体特性及胞外聚合物研究
根据第一章的实验结果，取20和60mg/L的AEW对分散态菌膜和粘附态菌膜处理10min，探究处理前后菌体细胞膜特性、质子驱动力的变化，并结合化学分析方法以及ATR-FTIR和Raman光谱技术的原位无损分析能力共同探究处理前后菌体EPS的组分和含量的变化。试验结果表明:AEW的处理破坏菌体细胞膜的完整性，浓度的升高具有显著的降低作用;受损的细胞膜会导致胞内物质的外泄，胞内结构暴露于外部环境中，进而使得大量杀菌剂有效成分进入细胞，引起胞内酸化，降低膜电位、胞内ATP和胞内pH，干扰正常的胞内代谢过程;AEW处理后EPS中蛋白和总糖含量显著降低，而EPS的反向添加对AEW的理化特性起显著的负面影响，表明EPS对AEW处理起阻碍作用，消耗其有效成分，降低杀菌效果，更多的EPS分泌是粘附菌膜更强耐受的原因之一;ATR-FTIR和Raman的结果显示，粘附态菌膜的光谱图与分散态菌膜和浮游菌具有显著差异，粘附态菌膜具有更为丰富的蛋白、多糖类谱峰，AEW处理后一些特征峰的消失和弱化验证了化学分析过程中EPS的消耗。
3.荧光假单胞菌耐受酸性电解水机制的蛋白质组学研究
利用蛋白组学技术从生物信息学角度挖掘三种状态菌在AEW处理下的耐受差异表达蛋白(Differentially expressed proteins，DEPs)。研究结果表明:AEW处理下，共有117个DEPs与粘附态菌膜耐受有关，166个DEPs与分散态菌膜耐受相关;浮游菌对照与分散态菌膜对照及粘附态菌膜对照各有577和484个DEPs表达。差异蛋白GO注释结果表明，DEPs在生物学过程方面主要参与细胞代谢、细胞组分组织及生物起源、单一生物过程;分子功能方面主要与结合、转运活性有关;细胞成分方面，主要与细胞组分、高分子复合体等有关。Pathway分析结果显示，两种菌膜经AEW处理前后的DEPs均被富集到耐受相关的通路中，主要位于双组分系统、ABC转运蛋白、核糖体和抗生素生物合成代谢通路中，参与消毒剂的外排以及菌体泳动相关的趋化性等功能以提高菌体的存活能力;而两种状态菌膜之间及每种菌膜与浮游菌之间的DEPs主要被富集到次级代谢物的生物合成、微生物在不同环境中的代谢和ABC转运蛋白等通路中，参与菌体移动、生长繁殖和菌膜形成等功能。