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铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种机会性致病菌，容易感染粘膜屏障受损的宿主细胞，容易造成禽畜的炎症及人体肺部疾病且死亡率很高。铜绿假单胞菌广泛存在于水、空气及粪尿中。铜绿假单胞菌容易获得多重抗药性，是目前全球公布的多重耐药菌之一。铜绿假单胞菌可以通过多种途径获得耐药性，包括多种抗生素修饰酶的表达、抗生素外排泵、染色体突变、自身膜通透性低和获得其他生物体耐药基因等。禽畜养殖过程中对铜绿假单胞菌感染进行抗生素治疗的过程中容易产生耐药性。同时，铜绿假单胞菌在环境中易形成生物被膜，作为研究生物被膜的模式菌株，这为铜绿假单胞菌的控制带来更大的威胁。
本研究中包括对天然抗菌肽SakacinP进行分子改造并研究其对铜绿假单胞菌的抑菌机理、铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响因素及控制、铜绿假单胞菌交叉耐药性及附属敏感性产生规律三个部分的内容。主要实验结果总结如下:
1.抗菌肤SakacinP的分子设计及对铜绿假单胞菌抑菌机理的研究。
截取SakacinP中的α-螺旋序列，并用精氨酸和赖氨酸替换其中的特定位置的氨基酸，以通过提高氨基酸序列的疏水性和增加正电荷的量。改造得到SakacinP16-R6、SakacinP16-R8及SakacinP16-R6共3条抗菌肽。经过改造后，抗菌肽的抑菌活性明显提高且抑菌谱变宽。对抗菌肽杀菌动力学测定结果显示其杀菌效果主要是浓度依赖型。综合多方面因素SakacinP16-R8的活性最高。对SakacinP16-R8的稳定性及安全性进行研究，发现盐离子会对其活性产生影响但不至失活。在小鼠巨噬细胞和铜绿假单胞菌的混合液中，SakacinP16-R8可以杀死铜绿假单胞菌且在4×MIC下细胞存活率在75％以上，安全性较高。通过测定经SakacinP16-R8处理后P.aeruginosa96846上清液中核酸和蛋白质的含量及流式细胞术实验结果表明该抗菌肽通过破坏铜绿假单胞菌细胞膜达到杀菌目的。
2.铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响因素及控制的研究
在实验室条件下研究了培养时间、温度、培养基种类、氯化钠含量、葡萄糖含量及PH对铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响，同时测定相应条件下铜绿假单胞菌悬浮菌液的浓度。实验中运用结晶紫染色法测定铜绿假单胞菌生物被膜的形成量。在低温、低PH及高NaCl和葡萄糖浓度下可以有效地抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成。另外，生物被膜形成能力与铜绿假单胞菌生长状况并不完全成正比。用84消毒液(84消毒液浓度通过有效氯的含量换算)、酒精、洗洁精和过氧化氢处理铜绿假单胞菌生物被膜，观察常用消毒剂对铜绿假单胞菌生物被膜的清除作用。结果发现，过氧化氢具有很好的清除效果，在实验设置最高浓度(6％)下均能清除超过50％的生物被膜。其他清除效果并不理想，其中84消毒液有一定的清除效果，有效氯含量在256μg/ml时可以清楚20％左右的生物被膜。同时，研究第一部分中分子改造所得的3条抗菌肽对铜绿假单胞菌的生物被膜的控制，发现能有效抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成。
3.铜绿假单胞菌交叉耐药性和附属敏感性的产生规律
用药敏孔板法测定铜绿假单胞菌的耐药性情况，选用10种抗生素对不具有耐药性的P.aeruginosaATCC27853及P.aeruginosa02818进行单一抗生素的耐药性人工诱导实验，在诱导结束后测定菌株对其他抗生素的敏感性。发现两株菌都在相对较短时间内对诱导药物产生耐药性。除多肽类的抗生素外，对其他抗生素的耐药性提高了32-128倍。而对多肽类的抗生素提高2倍之后基本不再提高。同时研究SakacinP16-R8对P.aeruginosaATCC27853的耐药性人工诱导实验可以看出，其耐药性进化趋势与多肽类药物诱导趋势相似，不会造成耐药性的大幅度和迅速增加。耐药菌株易对相同类型的抗生素产生交叉耐药性，而联合敏感性多发生在不同种类抗生素之间。但是两株菌对不同类抗生素之间产生交叉耐药性或联合敏感性的具体结果是不同的。对产生耐药性的菌株用敏感性增强的抗生素进行为期7天的二次诱导，之后用原来具有耐药性的抗生素对其做药敏试验，发现20株耐药菌株中有11株有耐药转变为敏感，剩余9株耐药性无明显变化，但MIC值均不会增加。
本研究中包括对天然抗菌肽SakacinP进行分子改造并研究其对铜绿假单胞菌的抑菌机理、铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响因素及控制、铜绿假单胞菌交叉耐药性及附属敏感性产生规律三个部分的内容。主要实验结果总结如下:
1.抗菌肤SakacinP的分子设计及对铜绿假单胞菌抑菌机理的研究。
截取SakacinP中的α-螺旋序列，并用精氨酸和赖氨酸替换其中的特定位置的氨基酸，以通过提高氨基酸序列的疏水性和增加正电荷的量。改造得到SakacinP16-R6、SakacinP16-R8及SakacinP16-R6共3条抗菌肽。经过改造后，抗菌肽的抑菌活性明显提高且抑菌谱变宽。对抗菌肽杀菌动力学测定结果显示其杀菌效果主要是浓度依赖型。综合多方面因素SakacinP16-R8的活性最高。对SakacinP16-R8的稳定性及安全性进行研究，发现盐离子会对其活性产生影响但不至失活。在小鼠巨噬细胞和铜绿假单胞菌的混合液中，SakacinP16-R8可以杀死铜绿假单胞菌且在4×MIC下细胞存活率在75％以上，安全性较高。通过测定经SakacinP16-R8处理后P.aeruginosa96846上清液中核酸和蛋白质的含量及流式细胞术实验结果表明该抗菌肽通过破坏铜绿假单胞菌细胞膜达到杀菌目的。
2.铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响因素及控制的研究
在实验室条件下研究了培养时间、温度、培养基种类、氯化钠含量、葡萄糖含量及PH对铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响，同时测定相应条件下铜绿假单胞菌悬浮菌液的浓度。实验中运用结晶紫染色法测定铜绿假单胞菌生物被膜的形成量。在低温、低PH及高NaCl和葡萄糖浓度下可以有效地抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成。另外，生物被膜形成能力与铜绿假单胞菌生长状况并不完全成正比。用84消毒液(84消毒液浓度通过有效氯的含量换算)、酒精、洗洁精和过氧化氢处理铜绿假单胞菌生物被膜，观察常用消毒剂对铜绿假单胞菌生物被膜的清除作用。结果发现，过氧化氢具有很好的清除效果，在实验设置最高浓度(6％)下均能清除超过50％的生物被膜。其他清除效果并不理想，其中84消毒液有一定的清除效果，有效氯含量在256μg/ml时可以清楚20％左右的生物被膜。同时，研究第一部分中分子改造所得的3条抗菌肽对铜绿假单胞菌的生物被膜的控制，发现能有效抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成。
3.铜绿假单胞菌交叉耐药性和附属敏感性的产生规律
用药敏孔板法测定铜绿假单胞菌的耐药性情况，选用10种抗生素对不具有耐药性的P.aeruginosaATCC27853及P.aeruginosa02818进行单一抗生素的耐药性人工诱导实验，在诱导结束后测定菌株对其他抗生素的敏感性。发现两株菌都在相对较短时间内对诱导药物产生耐药性。除多肽类的抗生素外，对其他抗生素的耐药性提高了32-128倍。而对多肽类的抗生素提高2倍之后基本不再提高。同时研究SakacinP16-R8对P.aeruginosaATCC27853的耐药性人工诱导实验可以看出，其耐药性进化趋势与多肽类药物诱导趋势相似，不会造成耐药性的大幅度和迅速增加。耐药菌株易对相同类型的抗生素产生交叉耐药性，而联合敏感性多发生在不同种类抗生素之间。但是两株菌对不同类抗生素之间产生交叉耐药性或联合敏感性的具体结果是不同的。对产生耐药性的菌株用敏感性增强的抗生素进行为期7天的二次诱导，之后用原来具有耐药性的抗生素对其做药敏试验，发现20株耐药菌株中有11株有耐药转变为敏感，剩余9株耐药性无明显变化，但MIC值均不会增加。