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大豆是优质的植物蛋白，营养价值高，但也是“八大”食物过敏原之一。大豆的脱敏正成为食品工业的研究热点，发酵是一种潜在降低大豆致敏性的生物处理方法，但植物乳杆菌发酵大豆蛋白对其致敏性的影响尚不清楚。本课题首先采用八株实验室自行分离的植物乳杆菌，研究了不同植物乳杆菌菌株发酵大豆分离蛋白(SPI)对其抗原性的影响，并通过蛋白降解与高级结构改变对植物乳杆菌脱敏SPI机制进行探讨，筛选得到最佳脱敏菌株。之后，从发酵时间、碳氮比、SPI浓度三个方面讨论发酵条件对植物乳杆菌脱敏大豆蛋白效果的影响。在此基础上，采用动态模拟胃肠道消化模型，探究植物乳杆菌B1-6发酵对SPI胃肠道消化稳定性及抗原性的影响。主要结论如下:
1、八株植物乳杆菌发酵SPI，酶联免疫吸附试验(ELISA)结果显示，其抗原性显著性降低(83.8％-94.8％)，植物乳杆菌ZR、L3-4、Dong、B1-6降低最明显且无显著差异(P＞0.05)，降低率分别为94.86％、94.20％、93.96％、91.94％。发酵引起SPI的可溶性蛋白含量下降(53.8％-82.8％)，及蛋白电泳条带减弱，尤其是β-伴大豆球蛋白(7S)α亚基、α亚基和β亚基条带几乎消失，植物乳杆菌Dong、B1-6发酵的7S和大豆球蛋白(11S)条带减弱最明显。肽含量(＜10kDa)在部分菌株发酵样品中增加，尤其是植物乳杆菌Y-1、B1-6，分别增加至0.335mg/mL和0.517mg/mL。发酵对SPI的高级结构产生重要影响，蛋白表面疏水性增加1.6-3.3倍，蛋白的空间结构展开，导致蛋白内部的氢键断裂和二级结构的β-折叠骨架暴露，β-股含量大幅上升，β-转角含量降低12.9％-21.9％，反平行式β-折叠降低23.5％-31.1％，分子间β-折叠、α-螺旋含量变化较小。主成分分析结果显示，SPI抗原性降低与肽含量、表面疏水性和二级结构β-股密切相关。植物乳杆菌发酵SPI对其抗原性的影响与蛋白的一级结构和高级结构有关。
2、通过单因素试验分析，研究发酵时间、碳氮比、SPI浓度对脱敏大豆蛋白的影响。随着发酵的进行，pH值逐渐下降，乳酸菌活菌数增加，SPI的可溶性蛋白含量降低，7S和11S电泳条带减弱，发酵36h后减弱趋于平稳，至48h时到达最低。SPI的抗原性持续降低，至48h降低92.14％。随着碳氮比的增加，pH值下降，乳酸菌活菌数增加，C/N为2∶5时，活菌数最高，pH值最低;SPI的抗原性和可溶性蛋白含量降低，分别降低至7.78％和115.16μg/mg，7S的β亚基条带消失;当C/N为1∶5和2∶5时，7S的α亚基、α亚基条带减弱最明显。随着SPI浓度增加，pH明显下降，活菌数升高，可溶性蛋白含量、抗原性显著降低、7S和11S电泳条带降解，当SPI浓度为5％时，活菌数增至最高的8.521g(CFU/mL)，抗原性降低92.91％，7S和11S电泳条带减弱显著。综上得到最优发酵条件为发酵时间48h、碳氮比2∶5、SPI浓度5％。在最优发酵条件下，采用蛋白组学非标定量法(Label-free)分析得出，发酵前后，SPI共有差异蛋白45种，其中31种蛋白表达下调，14种蛋白表达上调，使用生物信息学工具，对下调差异蛋白抗原表位进行预测，结合下调差异蛋白的丰度，得出SPI的抗原性降低率为53.27％-86.97％。发酵后，SPI与五位大豆过敏患者血清特异性IgE结合能力显著下降，分别降低73.47％、63.29％、38.72％、43.20％、63.5％，与预测的抗原性降低率较为一致，验证了抗原袁位预测结果。
3、采用动态模拟胃肠道消化模型，研究植物乳杆菌发酵对大豆蛋白消化稳定性及致敏性的影响。在胃消化时，发酵后的大豆蛋白(FSPI)相较于SPI水解效率更高，蛋白更容易水解，至胃消化180min时，FSPI分子量750kDa以上占比只有0.1％，分子量3.5kDa以下占比95.11％，低于SPI分子量750kDa以上占比的8.73％，高于分子量3.5kDa以下占比的87.48％，FSPI的7S和11SA3亚基蛋白电泳条带明显减弱，减弱情况大于SPI，游离氨基酸含量增加，与1号和4号血清特异性IgE的结合能力降低，降低效率高于SPI。大豆蛋白发酵后交联聚集，在胃肠道停留时间较长，水解作用时间较充裕，水解效率高与SPI。在十二指肠消化时，相较于SPI，FSPI的7S和11S条带基本消失，蛋白降解显著。至十二指肠消化30min时，FSPI分子量50kDa以上占比为零，分子量3.5kDa以下占比92.63％，总游离氨基酸含量增加至1384.8mg/100g，与1号和4号血清特异性IgE的结合能力低于SPI，发酵引起蛋白的聚集，FSPI在十二指肠的消化效率更高，抗原表位被水解破坏，致敏性降低。
1、八株植物乳杆菌发酵SPI，酶联免疫吸附试验(ELISA)结果显示，其抗原性显著性降低(83.8％-94.8％)，植物乳杆菌ZR、L3-4、Dong、B1-6降低最明显且无显著差异(P＞0.05)，降低率分别为94.86％、94.20％、93.96％、91.94％。发酵引起SPI的可溶性蛋白含量下降(53.8％-82.8％)，及蛋白电泳条带减弱，尤其是β-伴大豆球蛋白(7S)α亚基、α亚基和β亚基条带几乎消失，植物乳杆菌Dong、B1-6发酵的7S和大豆球蛋白(11S)条带减弱最明显。肽含量(＜10kDa)在部分菌株发酵样品中增加，尤其是植物乳杆菌Y-1、B1-6，分别增加至0.335mg/mL和0.517mg/mL。发酵对SPI的高级结构产生重要影响，蛋白表面疏水性增加1.6-3.3倍，蛋白的空间结构展开，导致蛋白内部的氢键断裂和二级结构的β-折叠骨架暴露，β-股含量大幅上升，β-转角含量降低12.9％-21.9％，反平行式β-折叠降低23.5％-31.1％，分子间β-折叠、α-螺旋含量变化较小。主成分分析结果显示，SPI抗原性降低与肽含量、表面疏水性和二级结构β-股密切相关。植物乳杆菌发酵SPI对其抗原性的影响与蛋白的一级结构和高级结构有关。
2、通过单因素试验分析，研究发酵时间、碳氮比、SPI浓度对脱敏大豆蛋白的影响。随着发酵的进行，pH值逐渐下降，乳酸菌活菌数增加，SPI的可溶性蛋白含量降低，7S和11S电泳条带减弱，发酵36h后减弱趋于平稳，至48h时到达最低。SPI的抗原性持续降低，至48h降低92.14％。随着碳氮比的增加，pH值下降，乳酸菌活菌数增加，C/N为2∶5时，活菌数最高，pH值最低;SPI的抗原性和可溶性蛋白含量降低，分别降低至7.78％和115.16μg/mg，7S的β亚基条带消失;当C/N为1∶5和2∶5时，7S的α亚基、α亚基条带减弱最明显。随着SPI浓度增加，pH明显下降，活菌数升高，可溶性蛋白含量、抗原性显著降低、7S和11S电泳条带降解，当SPI浓度为5％时，活菌数增至最高的8.521g(CFU/mL)，抗原性降低92.91％，7S和11S电泳条带减弱显著。综上得到最优发酵条件为发酵时间48h、碳氮比2∶5、SPI浓度5％。在最优发酵条件下，采用蛋白组学非标定量法(Label-free)分析得出，发酵前后，SPI共有差异蛋白45种，其中31种蛋白表达下调，14种蛋白表达上调，使用生物信息学工具，对下调差异蛋白抗原表位进行预测，结合下调差异蛋白的丰度，得出SPI的抗原性降低率为53.27％-86.97％。发酵后，SPI与五位大豆过敏患者血清特异性IgE结合能力显著下降，分别降低73.47％、63.29％、38.72％、43.20％、63.5％，与预测的抗原性降低率较为一致，验证了抗原袁位预测结果。
3、采用动态模拟胃肠道消化模型，研究植物乳杆菌发酵对大豆蛋白消化稳定性及致敏性的影响。在胃消化时，发酵后的大豆蛋白(FSPI)相较于SPI水解效率更高，蛋白更容易水解，至胃消化180min时，FSPI分子量750kDa以上占比只有0.1％，分子量3.5kDa以下占比95.11％，低于SPI分子量750kDa以上占比的8.73％，高于分子量3.5kDa以下占比的87.48％，FSPI的7S和11SA3亚基蛋白电泳条带明显减弱，减弱情况大于SPI，游离氨基酸含量增加，与1号和4号血清特异性IgE的结合能力降低，降低效率高于SPI。大豆蛋白发酵后交联聚集，在胃肠道停留时间较长，水解作用时间较充裕，水解效率高与SPI。在十二指肠消化时，相较于SPI，FSPI的7S和11S条带基本消失，蛋白降解显著。至十二指肠消化30min时，FSPI分子量50kDa以上占比为零，分子量3.5kDa以下占比92.63％，总游离氨基酸含量增加至1384.8mg/100g，与1号和4号血清特异性IgE的结合能力低于SPI，发酵引起蛋白的聚集，FSPI在十二指肠的消化效率更高，抗原表位被水解破坏，致敏性降低。