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丙二酰辅酶A是众多黄酮类化合物和多酮类化合物微生物法合成的关键限速前体物质，已经有许多研究通过增加胞内丙二酰辅酶A供给来突破合成途径瓶颈，但是目前的策略都依赖于传统的诱导表达系统，需要添加昂贵且对细胞有毒性的的诱导剂，并且无法实现发酵的动态调控，因此难以应用于大规模工业化生产。为了寻找一种高效且廉价的动态增加胞内丙二酰辅酶A供给的手段，摆脱对诱导剂的依赖，本研究构建了一套可以从乙酸高效合成丙二酰辅酶A的系统，并且利用基于群体感应(Quorum sensing，QS)系统构建的基因开关，实‘现了丙二酰辅酶A的自发高效积累。本文主要研究内容及结论如下:
1.以代谢副产物乙酸为前体物质的丙二酰辅酶A高效积累途径的构建
为了提高胞内丙二酰辅酶A供给，比较分别以丙二酸和乙酸为前体物质的丙二酰辅酶A合成途径，选择以代谢副产物乙酸作为前体物质;通过基因敲除的手段抑制了乙酰辅酶A的五个流出途径，提高胞内乙酰辅酶A浓度;通过过表达不同来源的乙酰辅酶A合成酶实现从乙酸到乙酰辅酶A的转化，进一步提高胞内乙酰辅酶A含量;通过过表达不同来源的乙酰辅酶A羧化酶将乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A;探索不同生物素连接酶对乙酰辅酶A羧化酶活性的影响。最终确定来自大肠杆菌(Escherichia coli)的乙酰辅酶A合成酶Acs有最高的乙酰辅酶A合成活性，来自肠沙门氏菌(Salmonella enterica)的乙酰辅酶A羧化酶SeaccA、SeaccC、SeaccD在来自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的生物素连接酶CgbirA的协助下具有最高的丙二酰辅酶A合成活性，胞内丙二酰辅酶A浓度最高达到0.812nmol/mgDCW，将该底座细胞用于柚皮素的微生物法合成，柚皮素产量最高达到252.31mg/L。
2.基于群体感应系统的基因开关构建及活力比较
为了实现丙二酰辅酶A的动态自发积累，在工程菌内重构了来自费氏弧菌(Vibrio fischeri)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的共计四套群体感应系统。将与菌株QS系统相关的启动子序列、信号分子合成酶基因、受体蛋白基因克隆出来并在工程菌中组装，发现基因自带的启动子启动强度较弱，QS系统无法在工程菌中正常运行;因此，为信号分子合成酶基因和受体蛋白基因更换启动强度更高的T7启动子，在IPTG诱导下提高胞内信号分子和受体蛋白的浓度，使胞内信号分子-受体蛋白复合体浓度达到启动子的检测阈值并成功启动报告基因绿色荧光蛋白的表达，QS系统初步构建成功;为了实现QS系统的自主调控，避免诱导剂的添加，筛选出具有高启动强度并且在各种碳源条件下都能正常工作的组成型启动子trc(lost operon)，为信号分子合成酶和受体蛋白更换组成型启动子，实现了信号分子合成酶和受体蛋白的组成型表达，完全自主调控的基因开关构建完成。比较了四套群体感应系统活力，确定基于费氏弧菌的Lux群体感应系统构建的基因开关有最高的启动活力。
3.严谨调控的丙二酰辅酶A自发高效合成系统构建
实验发现已构建的基因开关存在表达渗漏，为了降低渗漏，实现基因开关对靶基因的严谨调控，对启动子元件进行定向改造。将启动子PluxI-10区下游的序列更换为T7启动子的RBS位点，发现启动子-10区下游到转录起点的序列与RNA聚合酶和启动子的结合相关，启动子组成型启动;对启动子-35区上游序列进行不同长度的截短以探索启动子的最佳启动长度，发现启动子-35区上游序列和启动子的渗漏调节以及启动子启动转录的效率相关，构建一个严谨调控且具有高启动强度的基因开关。将第二章构建的丙二酰辅酶A高效积累途径和严谨调控的基因开关相结合，构建底座细胞，使工程菌在发酵开始阶段不表达重组蛋白，保持良好的生长状态，OD600达到0.5后自发启动丙二酰辅酶A的高效积累，胞内代谢流被重定向，流向目标产物丙二酰辅酶A，胞内丙二酰辅酶A浓度最高达到0.325nmol/mgDCW。将底座细胞应用于黄酮类化合物骨架物质柚皮素生产，柚皮素的产量从起始的15.776mg/L增加到80.69mg/L，增长了411.5％。
1.以代谢副产物乙酸为前体物质的丙二酰辅酶A高效积累途径的构建
为了提高胞内丙二酰辅酶A供给，比较分别以丙二酸和乙酸为前体物质的丙二酰辅酶A合成途径，选择以代谢副产物乙酸作为前体物质;通过基因敲除的手段抑制了乙酰辅酶A的五个流出途径，提高胞内乙酰辅酶A浓度;通过过表达不同来源的乙酰辅酶A合成酶实现从乙酸到乙酰辅酶A的转化，进一步提高胞内乙酰辅酶A含量;通过过表达不同来源的乙酰辅酶A羧化酶将乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A;探索不同生物素连接酶对乙酰辅酶A羧化酶活性的影响。最终确定来自大肠杆菌(Escherichia coli)的乙酰辅酶A合成酶Acs有最高的乙酰辅酶A合成活性，来自肠沙门氏菌(Salmonella enterica)的乙酰辅酶A羧化酶SeaccA、SeaccC、SeaccD在来自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的生物素连接酶CgbirA的协助下具有最高的丙二酰辅酶A合成活性，胞内丙二酰辅酶A浓度最高达到0.812nmol/mgDCW，将该底座细胞用于柚皮素的微生物法合成，柚皮素产量最高达到252.31mg/L。
2.基于群体感应系统的基因开关构建及活力比较
为了实现丙二酰辅酶A的动态自发积累，在工程菌内重构了来自费氏弧菌(Vibrio fischeri)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的共计四套群体感应系统。将与菌株QS系统相关的启动子序列、信号分子合成酶基因、受体蛋白基因克隆出来并在工程菌中组装，发现基因自带的启动子启动强度较弱，QS系统无法在工程菌中正常运行;因此，为信号分子合成酶基因和受体蛋白基因更换启动强度更高的T7启动子，在IPTG诱导下提高胞内信号分子和受体蛋白的浓度，使胞内信号分子-受体蛋白复合体浓度达到启动子的检测阈值并成功启动报告基因绿色荧光蛋白的表达，QS系统初步构建成功;为了实现QS系统的自主调控，避免诱导剂的添加，筛选出具有高启动强度并且在各种碳源条件下都能正常工作的组成型启动子trc(lost operon)，为信号分子合成酶和受体蛋白更换组成型启动子，实现了信号分子合成酶和受体蛋白的组成型表达，完全自主调控的基因开关构建完成。比较了四套群体感应系统活力，确定基于费氏弧菌的Lux群体感应系统构建的基因开关有最高的启动活力。
3.严谨调控的丙二酰辅酶A自发高效合成系统构建
实验发现已构建的基因开关存在表达渗漏，为了降低渗漏，实现基因开关对靶基因的严谨调控，对启动子元件进行定向改造。将启动子PluxI-10区下游的序列更换为T7启动子的RBS位点，发现启动子-10区下游到转录起点的序列与RNA聚合酶和启动子的结合相关，启动子组成型启动;对启动子-35区上游序列进行不同长度的截短以探索启动子的最佳启动长度，发现启动子-35区上游序列和启动子的渗漏调节以及启动子启动转录的效率相关，构建一个严谨调控且具有高启动强度的基因开关。将第二章构建的丙二酰辅酶A高效积累途径和严谨调控的基因开关相结合，构建底座细胞，使工程菌在发酵开始阶段不表达重组蛋白，保持良好的生长状态，OD600达到0.5后自发启动丙二酰辅酶A的高效积累，胞内代谢流被重定向，流向目标产物丙二酰辅酶A，胞内丙二酰辅酶A浓度最高达到0.325nmol/mgDCW。将底座细胞应用于黄酮类化合物骨架物质柚皮素生产，柚皮素的产量从起始的15.776mg/L增加到80.69mg/L，增长了411.5％。