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RNAi(RNA interference)是dsRNA介导的一种转录后基因沉默现象，RNAi技术自发现以来已被广泛应用于基因功能的研究，近年来国际上普遍认为基于RNAi的害虫防治技术在植物保护领域具有潜在的应用价值。然而，昆虫RNA干扰效率的差异在很大程度上制约着这一技术在害虫控制中的应用。影响RNAi效率的因素有很多，dsRNA在血淋巴和中肠液中的稳定性是影响RNAi效率最关键的因素。本文重点关注飞蝗(Locusta migratoria)体内的dsRNA降解酶基因的分子特性及其生物学功能，揭示LmdsRNases对飞蝗注射和饲喂dsRNA干扰效率差异的影响机制，为探索昆虫RNAi效率差异机制提供理论基础，进而促进RNAi技术在害虫防治的应用。主要研究内容如下：
一、飞蝗dsRNA降解酶(LmdsRNases)的基因鉴定
首先，基于飞蝗基因组和转录组数据库，搜索LmdsRNases序列，得到飞蝗4个LmdsRNases基因，分别命名为LmdsRNase1、LmdsRNase2、LmdsRNase3和LmdsRNase4。其次，对所获基因进行全长cDNA序列验证、基因结构以及功能域分析，结果表明，上述4个基因的开放阅读框分别为1266bp、1215bp、1170bp和1281bp，分别编码422、405、390和427个氨基酸，均具有EndonucleaseNS结构域，除LmdsRNase3外均具有信号肽序列。本文还选取了6个目19种昆虫的dsRNase氨基酸序列序列，与真核生物EndonucleaseG以及细菌DNA/RNAnon-specificnuclease共同构建了系统进化树，发现昆虫dsRNases和真核生物EndonucleaseG分别聚为一枝，均来源于细菌DNA/RNAnon-specificnuclease。
二、飞蝗dsRNA降解酶(LmdsRNases)的分子特性和组织定位
本文提取了飞蝗五龄不同天数的整虫和五龄若虫表皮、中肠及血淋巴等10个组织部位的总RNA，采用RT-qPCR方法检测发现，LmdsRNases在五龄整个龄期均有表达，其中LmdsRNase1和LmdsRNase4在血淋巴组织高表达，而LmdsRNase2和LmdsRNase3在中肠组织高表达。进一步采用原核表达系统分别获得了LmdsRNases的抗原肽段，之后制备了LmdsRNase2和LmdsRNase3的抗体，经检测，抗体效价和特异性良好，LmdsRNase2和LmdsRNase3蛋白均可定位于中肠细胞质，但LmdsRNase3的蛋白表达量明显低于LmdsRNase2。上述结果提示飞蝗LmdsRNases可能在功能上出现分化。
三、飞蝗中肠高表达LmdsRNases对饲喂dsRNA干扰效率的影响
LmdsRNase2和LmdsRNase3在飞蝗中肠高表达，是否是导致飞蝗饲喂dsRNA干扰效率低的关键因素？围绕这一科学问题，我们首先比较了飞蝗通过注射和饲喂dsRNA两种不同的导入方式诱导RNA干扰的效率差异，发现飞蝗饲喂dsRNA干扰效率极低，而注射dsRNA干扰效率则很高。dsRNA在飞蝗血淋巴中很稳定，而在中肠液中会被快速降解。其次，采用RNAi技术沉默中肠高表达的LmdsRNase2和LmdsRNase3后，检测中肠液降解dsRNA的能力，发现沉默LmdsRNase2之后，中肠液降解dsRNA的能力明显减弱，而沉默LmdsRNase3之后，中肠液依然可以快速降解dsRNA。表明LmdsRNase2可能是飞蝗中肠dsRNA快速降解的关键因子。之后，采用二次RNAi技术分别沉默LmdsRNase2和LmdsRNase3后再饲喂靶基因(几丁质酶10和几丁质合成酶1)的dsRNA，并观察表型，发现沉默LmdsRNase2后分别饲喂两个靶基因dsRNA的处理组虫体均出现蜕皮困难而死亡的表型，进一步采用qPCR和几丁质染色实验证实，飞蝗出现此表型的原因是靶基因表达量下降导致飞蝗表皮几丁质合成和降解受阻而产生。进一步采用杆状病毒-昆虫细胞表达系统成功获得LmdsRNase2和LmdsRNase3融合蛋白，发现LmdsRNase2可以在pH6-10的环境条件下快速降解dsRNA，而LmdsRNase3几乎不具有降解dsRNA的能力。研究结果揭示了飞蝗饲喂dsRNA干扰无效的分子机制，分析认为，飞蝗饲喂dsRNA干扰无效的主要原因是飞蝗中肠组织高表达的LmdsRNase2分泌到中肠液中，将dsRNA降解为碎片，dsRNA最终不能进入细胞，从而导致干扰无效。
四、飞蝗血淋巴高表达LmdsRNases的生物学功能
LmdsRNase1和LmdsRNase4主要在飞蝗血淋巴高表达，为什么飞蝗注射dsRNA干扰效率依然很高？围绕上述科学问题，本文采用昆虫细胞-杆状病毒表达系统，异源表达LmdsRNase1和LmdsRNase4融合蛋白，体外检测其降解dsRNA的能力以及酶学特性。结果发现，LmdsRNase1在pH5.0的条件下可快速降解dsRNA，而LmdsRNase4在任何条件下均不能降解dsRNA。其次，对飞蝗的4个LmdsRNases的双链核酸底物选择性进行了检测，发现LmdsRNase1和LmdsRNase2可以降解dsRNA，而LmdsRNase2和LmdsRNase3对siRNA具有微弱的降解作用，LmdsRNase1和LmdsRNase4对dsDNA有微弱的降解作用。最后，本文检测了不同pH条件对飞蝗血淋巴和中肠液总蛋白的影响，发现飞蝗血淋巴中虽然存在着LmdsRNase1这一可以降解dsRNA的酶，但在飞蝗血淋巴生理pH7.0条件下，该酶不能降解dsRNA，故而dsRNA可在血淋巴中残留较长时间直至被细胞吸收，从而产生高效基因沉默现象。
综上所述，本文通过对飞蝗LmdsRNases生物学功能进行了较为系统的研究，明确了飞蝗注射和饲喂dsRNA干扰效率差异的影响因素。昆虫dsRNases受其生理pH条件的影响，最终影响着昆虫RNAi的效率。本文的研究结果为昆虫RNAi效率差异机制提供了理论基础，为利用RNAi技术防治害虫提供了新思路和新方法，促进了RNAi技术在害虫防治中的应用。
一、飞蝗dsRNA降解酶(LmdsRNases)的基因鉴定
首先，基于飞蝗基因组和转录组数据库，搜索LmdsRNases序列，得到飞蝗4个LmdsRNases基因，分别命名为LmdsRNase1、LmdsRNase2、LmdsRNase3和LmdsRNase4。其次，对所获基因进行全长cDNA序列验证、基因结构以及功能域分析，结果表明，上述4个基因的开放阅读框分别为1266bp、1215bp、1170bp和1281bp，分别编码422、405、390和427个氨基酸，均具有EndonucleaseNS结构域，除LmdsRNase3外均具有信号肽序列。本文还选取了6个目19种昆虫的dsRNase氨基酸序列序列，与真核生物EndonucleaseG以及细菌DNA/RNAnon-specificnuclease共同构建了系统进化树，发现昆虫dsRNases和真核生物EndonucleaseG分别聚为一枝，均来源于细菌DNA/RNAnon-specificnuclease。
二、飞蝗dsRNA降解酶(LmdsRNases)的分子特性和组织定位
本文提取了飞蝗五龄不同天数的整虫和五龄若虫表皮、中肠及血淋巴等10个组织部位的总RNA，采用RT-qPCR方法检测发现，LmdsRNases在五龄整个龄期均有表达，其中LmdsRNase1和LmdsRNase4在血淋巴组织高表达，而LmdsRNase2和LmdsRNase3在中肠组织高表达。进一步采用原核表达系统分别获得了LmdsRNases的抗原肽段，之后制备了LmdsRNase2和LmdsRNase3的抗体，经检测，抗体效价和特异性良好，LmdsRNase2和LmdsRNase3蛋白均可定位于中肠细胞质，但LmdsRNase3的蛋白表达量明显低于LmdsRNase2。上述结果提示飞蝗LmdsRNases可能在功能上出现分化。
三、飞蝗中肠高表达LmdsRNases对饲喂dsRNA干扰效率的影响
LmdsRNase2和LmdsRNase3在飞蝗中肠高表达，是否是导致飞蝗饲喂dsRNA干扰效率低的关键因素？围绕这一科学问题，我们首先比较了飞蝗通过注射和饲喂dsRNA两种不同的导入方式诱导RNA干扰的效率差异，发现飞蝗饲喂dsRNA干扰效率极低，而注射dsRNA干扰效率则很高。dsRNA在飞蝗血淋巴中很稳定，而在中肠液中会被快速降解。其次，采用RNAi技术沉默中肠高表达的LmdsRNase2和LmdsRNase3后，检测中肠液降解dsRNA的能力，发现沉默LmdsRNase2之后，中肠液降解dsRNA的能力明显减弱，而沉默LmdsRNase3之后，中肠液依然可以快速降解dsRNA。表明LmdsRNase2可能是飞蝗中肠dsRNA快速降解的关键因子。之后，采用二次RNAi技术分别沉默LmdsRNase2和LmdsRNase3后再饲喂靶基因(几丁质酶10和几丁质合成酶1)的dsRNA，并观察表型，发现沉默LmdsRNase2后分别饲喂两个靶基因dsRNA的处理组虫体均出现蜕皮困难而死亡的表型，进一步采用qPCR和几丁质染色实验证实，飞蝗出现此表型的原因是靶基因表达量下降导致飞蝗表皮几丁质合成和降解受阻而产生。进一步采用杆状病毒-昆虫细胞表达系统成功获得LmdsRNase2和LmdsRNase3融合蛋白，发现LmdsRNase2可以在pH6-10的环境条件下快速降解dsRNA，而LmdsRNase3几乎不具有降解dsRNA的能力。研究结果揭示了飞蝗饲喂dsRNA干扰无效的分子机制，分析认为，飞蝗饲喂dsRNA干扰无效的主要原因是飞蝗中肠组织高表达的LmdsRNase2分泌到中肠液中，将dsRNA降解为碎片，dsRNA最终不能进入细胞，从而导致干扰无效。
四、飞蝗血淋巴高表达LmdsRNases的生物学功能
LmdsRNase1和LmdsRNase4主要在飞蝗血淋巴高表达，为什么飞蝗注射dsRNA干扰效率依然很高？围绕上述科学问题，本文采用昆虫细胞-杆状病毒表达系统，异源表达LmdsRNase1和LmdsRNase4融合蛋白，体外检测其降解dsRNA的能力以及酶学特性。结果发现，LmdsRNase1在pH5.0的条件下可快速降解dsRNA，而LmdsRNase4在任何条件下均不能降解dsRNA。其次，对飞蝗的4个LmdsRNases的双链核酸底物选择性进行了检测，发现LmdsRNase1和LmdsRNase2可以降解dsRNA，而LmdsRNase2和LmdsRNase3对siRNA具有微弱的降解作用，LmdsRNase1和LmdsRNase4对dsDNA有微弱的降解作用。最后，本文检测了不同pH条件对飞蝗血淋巴和中肠液总蛋白的影响，发现飞蝗血淋巴中虽然存在着LmdsRNase1这一可以降解dsRNA的酶，但在飞蝗血淋巴生理pH7.0条件下，该酶不能降解dsRNA，故而dsRNA可在血淋巴中残留较长时间直至被细胞吸收，从而产生高效基因沉默现象。
综上所述，本文通过对飞蝗LmdsRNases生物学功能进行了较为系统的研究，明确了飞蝗注射和饲喂dsRNA干扰效率差异的影响因素。昆虫dsRNases受其生理pH条件的影响，最终影响着昆虫RNAi的效率。本文的研究结果为昆虫RNAi效率差异机制提供了理论基础，为利用RNAi技术防治害虫提供了新思路和新方法，促进了RNAi技术在害虫防治中的应用。