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金属硫蛋白(Metallothionein, MTs)是一类低分子量，富含Cys的超家族蛋白，能够通过巯基的螯合作用结合金属离子发挥解毒功能，通过巯基的氧化作用消减ROS降低对细胞的氧化损伤，同时参与必需金属离子的平衡代谢调节，在细胞增殖、凋亡、衰老等一系列生理生化反应过程中发挥重要作用。
嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)是一种单细胞真核生物，由于缺乏细胞壁,对外界环境的敏感程度高，成为众多探究金属离子毒性和氧化应激效应的重要模式生物之一。环境应激的MTs在四膜虫中具有独特的进化特征和表达模式。四膜虫MTs在分类系统中属于第7家族，依据诱导物类型和半胱氨酸残基排布特征划分为镉诱导型金属硫蛋白(CdMT)和铜诱导型金属硫蛋白(CuMT)。为了分析不同MT的功能及其表达调控机制，本研究通过删除突变、重组表达、抗氧化功能分析及表达调控因子的鉴定，对不同MTs的功能和转录调控机制进行了分析，获得主要结果如下：
1.MTT1和MTT2的模体具有不同的离子结合能力
嗜热四膜虫MTT1和MTT2在细胞中发挥着不同的生物学功能，其半胱氨酸呈现不同的排布方式，MTT1中Cys的排布方式主要是以“CC”和“CCC”模式构成，而MTT2中Cys的排布方式主要是以“CXC”模式构成。为了分析四膜虫MTs序列长度和Cys排布结构与功能之间的关系，MTT1和MTT2以及截短的TM1和TM2的重组质粒被分别构建，并在大肠杆菌(BL21)中表达、纯化。E.coli/pGEX-MTT1、E.coli/pGEX-TM1、E.coli/pGEX-MTT2和E.coli/pGEX-TM2对Cd2+的IC50值分别为：674.4μM、445.6μM、304.2μM和287.1μM；对Cu2+的IC50值分别为：811.2μM、585.9μM、505.1μM和429.5μM。表达有MTT1和TM1的大肠杆菌细胞表现出对Cd2+具有更高的耐受性和累积能力；而表达MTT2和TM2的大肠杆菌细胞表现出对Cu2+具有更高的耐受性和累积能力。MTT1和TM1对Cd2+具有偏好性且具有较强结合能力，而MTT2和TM2对Cu2+具有偏好性且具有较强结合能力。表明Cys残基的数量和排布结构对MTs的金属性发挥着重要作用。
2.MTT5与MTT1/3和MTT2/4存在功能补偿
嗜热四膜虫基因组含具有5种金属硫蛋白基因MTT1、MTT2、MTT3、MTT4和MTT5。MTT1和MTT3基因以串联形式位于CH445533染色体上，编码的氨基酸序列一致性为76%；MTT2和MTT4基因以串联形式位于CH445730染色体上，编码的氨基酸序列一致性达到98%；MTT5基因独立位于大核CH445598染色体上。MTT5长度为300bp,无内含子，编码99aa，其中包含24个Cys，占总氨基酸的24.2%。通过同源重组的方法获得MTT5敲除细胞株。Cd2+离子胁迫下MTT1和MTT3的表达水平上调，Cu2+离子胁迫下MTT2和MTT4的表达水平上调。表明MTT5不仅参与重金属解毒，而且在Cu2+的平衡调节过程中也发挥着作用
3.MTT5具有更强的Pb2+结合能力
为了分析MTT5的功能，构建了重组质粒pGEX-MTT5，转化大肠杆菌，表达重组蛋白GST-MTT5，通过亲和层析纯化，获得电泳纯的重组蛋白。荧光猝灭实验表明，一个apoMTT5分子能够结合8个Cd2+、8个Pb2+或者12个Cu2+。Pb-MTT5、Cd-MTT5和Cu-MTT5复合物和DTNB初速度依次递减的顺序为：MTT5/Pb2+＜MTT5/Cd2+＜MTT5/Cu2+，表明MTT5结合金属离子的能力由强到弱依次为：Pb2+＞Cd2+＞Cu2+。重金属离子对E.coli/pGEX-MTT5的最大半抑制浓度分别为：Cu2+(483.9μM)、Pb2+(410.7μM)和Cd2+(130.8μM)。而大肠杆菌E.coli/pGEX-MTT5累积Pb2+、Cd2+和Cu2+分别为62.9ng/g、47.6ng/g和34.2ng/g；表明E.coli/pGEX-MTT5累积Pb2+的能力显著增强。
4.MTs和抗氧化酶以协同作用方式调控四膜虫金属诱导的氧化应激
金属硫蛋白不仅在重金属离子解毒，基本离子代谢方面起重要的调节作用，而且在自由基的清除和抗氧化方面发挥重要作用。ΔMTT1,MTT3、ΔMTT2,MTT4和ΔMTT5对Pb2+的EC50值分别为213.8μM、441.7μM和176μM；ΔMTT1,MTT3、ΔMTT2,MTT4和ΔMTT5对Cd2+的EC50值分别为17.16μM、31.95μM和22.73μM；ΔMTT1,MTT3、ΔMTT2,MTT4和ΔMTT5对Cu2+的EC50值分别为58.66μM、44.42μM和83.12μM。重金属离子(Pb2+、Cd2+和Cu2+)胁迫下，突变体细胞内ROS显著增加。ΔMTT2,MTT4在Cu2+胁迫下，抗氧化酶基因SOD、CAT和GPX的表达水平显著升高(P＜0.05)。ΔMTT1,MTT3和ΔMTT5在Pb2+和Cd2+的胁迫下，SOD、CAT和GPX的表达水平显著升高。然而，重金属离子胁迫下，抗氧化酶的活性未能相应增加。结果表明，MTs和抗氧化酶以协同作用方式调控四膜虫金属诱导的氧化应激。
5.锌指蛋白Zfp1参与MTs基因的表达
高等生物MT基因的转录受MTF-1的调控，四膜虫中存在多种进化保守的含有锌指结构域的转录因子。锌指蛋白基因ZFP1，无内含子，全长2160bp，编码719aa。通过同源重组获得ΔZFP1细胞，ΔZFP1对Cu2+和Cd2+的EC50值分别为53.0μM和25.3μM，低于野生型细胞83.1μM和32.8μM。Cu2+诱导下，ΔZFP1细胞中MTT2、MTT3、MTT4和MTT5的转录水平降低，MTT1转录水平上调；Cd2+诱导下，MTT4转录水平降低，MTT3和MTT5的转录水平上调，说明敲除ZFP1基因影响了细胞对Cu2+和Cd2+的耐受性,ZFP1的缺失导致Cu2+和Cd2+诱导下MTs基因转录水平变化，表明Zfp1参与了四膜虫MTs基因的转录调控。
总之，本研究以原生动物纤毛类嗜热四膜虫为研究材料，分析了两种MTs亚型MTT1和MTT2由于Cys排布方式的不同对MTs功能的影响；分析了金属硫蛋白MTT5的结构和功能；通过基因敲除MTT5，分析了不同MT基因之间在重金属胁迫下的相互补偿作用关系；通过对不同突变体细胞中抗氧化酶基因的表达和活性分析，表明MTs和抗氧化酶是以协同作用方式调控四膜虫金属离子诱导的氧化应激；通过功能基因筛选，初步探究了锌指蛋白Zfp1参与MTs基因表达调控。本研究从原生动物角度为深入揭示真核生物MT的进化和功能提供了新的科学数据。
嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)是一种单细胞真核生物，由于缺乏细胞壁,对外界环境的敏感程度高，成为众多探究金属离子毒性和氧化应激效应的重要模式生物之一。环境应激的MTs在四膜虫中具有独特的进化特征和表达模式。四膜虫MTs在分类系统中属于第7家族，依据诱导物类型和半胱氨酸残基排布特征划分为镉诱导型金属硫蛋白(CdMT)和铜诱导型金属硫蛋白(CuMT)。为了分析不同MT的功能及其表达调控机制，本研究通过删除突变、重组表达、抗氧化功能分析及表达调控因子的鉴定，对不同MTs的功能和转录调控机制进行了分析，获得主要结果如下：
1.MTT1和MTT2的模体具有不同的离子结合能力
嗜热四膜虫MTT1和MTT2在细胞中发挥着不同的生物学功能，其半胱氨酸呈现不同的排布方式，MTT1中Cys的排布方式主要是以“CC”和“CCC”模式构成，而MTT2中Cys的排布方式主要是以“CXC”模式构成。为了分析四膜虫MTs序列长度和Cys排布结构与功能之间的关系，MTT1和MTT2以及截短的TM1和TM2的重组质粒被分别构建，并在大肠杆菌(BL21)中表达、纯化。E.coli/pGEX-MTT1、E.coli/pGEX-TM1、E.coli/pGEX-MTT2和E.coli/pGEX-TM2对Cd2+的IC50值分别为：674.4μM、445.6μM、304.2μM和287.1μM；对Cu2+的IC50值分别为：811.2μM、585.9μM、505.1μM和429.5μM。表达有MTT1和TM1的大肠杆菌细胞表现出对Cd2+具有更高的耐受性和累积能力；而表达MTT2和TM2的大肠杆菌细胞表现出对Cu2+具有更高的耐受性和累积能力。MTT1和TM1对Cd2+具有偏好性且具有较强结合能力，而MTT2和TM2对Cu2+具有偏好性且具有较强结合能力。表明Cys残基的数量和排布结构对MTs的金属性发挥着重要作用。
2.MTT5与MTT1/3和MTT2/4存在功能补偿
嗜热四膜虫基因组含具有5种金属硫蛋白基因MTT1、MTT2、MTT3、MTT4和MTT5。MTT1和MTT3基因以串联形式位于CH445533染色体上，编码的氨基酸序列一致性为76%；MTT2和MTT4基因以串联形式位于CH445730染色体上，编码的氨基酸序列一致性达到98%；MTT5基因独立位于大核CH445598染色体上。MTT5长度为300bp,无内含子，编码99aa，其中包含24个Cys，占总氨基酸的24.2%。通过同源重组的方法获得MTT5敲除细胞株。Cd2+离子胁迫下MTT1和MTT3的表达水平上调，Cu2+离子胁迫下MTT2和MTT4的表达水平上调。表明MTT5不仅参与重金属解毒，而且在Cu2+的平衡调节过程中也发挥着作用
3.MTT5具有更强的Pb2+结合能力
为了分析MTT5的功能，构建了重组质粒pGEX-MTT5，转化大肠杆菌，表达重组蛋白GST-MTT5，通过亲和层析纯化，获得电泳纯的重组蛋白。荧光猝灭实验表明，一个apoMTT5分子能够结合8个Cd2+、8个Pb2+或者12个Cu2+。Pb-MTT5、Cd-MTT5和Cu-MTT5复合物和DTNB初速度依次递减的顺序为：MTT5/Pb2+＜MTT5/Cd2+＜MTT5/Cu2+，表明MTT5结合金属离子的能力由强到弱依次为：Pb2+＞Cd2+＞Cu2+。重金属离子对E.coli/pGEX-MTT5的最大半抑制浓度分别为：Cu2+(483.9μM)、Pb2+(410.7μM)和Cd2+(130.8μM)。而大肠杆菌E.coli/pGEX-MTT5累积Pb2+、Cd2+和Cu2+分别为62.9ng/g、47.6ng/g和34.2ng/g；表明E.coli/pGEX-MTT5累积Pb2+的能力显著增强。
4.MTs和抗氧化酶以协同作用方式调控四膜虫金属诱导的氧化应激
金属硫蛋白不仅在重金属离子解毒，基本离子代谢方面起重要的调节作用，而且在自由基的清除和抗氧化方面发挥重要作用。ΔMTT1,MTT3、ΔMTT2,MTT4和ΔMTT5对Pb2+的EC50值分别为213.8μM、441.7μM和176μM；ΔMTT1,MTT3、ΔMTT2,MTT4和ΔMTT5对Cd2+的EC50值分别为17.16μM、31.95μM和22.73μM；ΔMTT1,MTT3、ΔMTT2,MTT4和ΔMTT5对Cu2+的EC50值分别为58.66μM、44.42μM和83.12μM。重金属离子(Pb2+、Cd2+和Cu2+)胁迫下，突变体细胞内ROS显著增加。ΔMTT2,MTT4在Cu2+胁迫下，抗氧化酶基因SOD、CAT和GPX的表达水平显著升高(P＜0.05)。ΔMTT1,MTT3和ΔMTT5在Pb2+和Cd2+的胁迫下，SOD、CAT和GPX的表达水平显著升高。然而，重金属离子胁迫下，抗氧化酶的活性未能相应增加。结果表明，MTs和抗氧化酶以协同作用方式调控四膜虫金属诱导的氧化应激。
5.锌指蛋白Zfp1参与MTs基因的表达
高等生物MT基因的转录受MTF-1的调控，四膜虫中存在多种进化保守的含有锌指结构域的转录因子。锌指蛋白基因ZFP1，无内含子，全长2160bp，编码719aa。通过同源重组获得ΔZFP1细胞，ΔZFP1对Cu2+和Cd2+的EC50值分别为53.0μM和25.3μM，低于野生型细胞83.1μM和32.8μM。Cu2+诱导下，ΔZFP1细胞中MTT2、MTT3、MTT4和MTT5的转录水平降低，MTT1转录水平上调；Cd2+诱导下，MTT4转录水平降低，MTT3和MTT5的转录水平上调，说明敲除ZFP1基因影响了细胞对Cu2+和Cd2+的耐受性,ZFP1的缺失导致Cu2+和Cd2+诱导下MTs基因转录水平变化，表明Zfp1参与了四膜虫MTs基因的转录调控。
总之，本研究以原生动物纤毛类嗜热四膜虫为研究材料，分析了两种MTs亚型MTT1和MTT2由于Cys排布方式的不同对MTs功能的影响；分析了金属硫蛋白MTT5的结构和功能；通过基因敲除MTT5，分析了不同MT基因之间在重金属胁迫下的相互补偿作用关系；通过对不同突变体细胞中抗氧化酶基因的表达和活性分析，表明MTs和抗氧化酶是以协同作用方式调控四膜虫金属离子诱导的氧化应激；通过功能基因筛选，初步探究了锌指蛋白Zfp1参与MTs基因表达调控。本研究从原生动物角度为深入揭示真核生物MT的进化和功能提供了新的科学数据。