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衰老是老龄化社会持续关注的社会和经济学问题之一，也是目前生物医药领域研究的热点。国际医学学术界公认：生命最可怕的对手是衰老，衰老危害着人类的健康，是众多疾病的高风险因素。过度老龄化问题是对世界人口的另一个严重威胁。医学界将衰老分为生理性和病理性两类，前者是事物存在的规律，是生命过程中不可避免的自然现象，而后者则由各种内外因素使生理发生变化，导致疾病发生，加速衰老。病理性衰老是抗衰老医学预防的重点，也是人类一直与之抗争的主题。随着各种癌症及疑难疾病的逐年攀升，人们试图通过不同渠道研究抗衰老药物或通过饮食结构的改善提高健康水平,并寻找天然食物中可能的活性分子以对抗或预防过早的衰老。本课题组前期研究表明：荞麦种子富含蛋白质，氨基酸和维生素B1和B2，膳食纤维，矿物质等其他作物没有或含量较少的生物活性成分，如荞麦胰蛋白酶抑制剂具有多种功效，包括促进肝癌细胞和宫颈癌细胞等实体瘤细胞的凋亡、延长秀丽隐杆线虫的寿命以及缓解Aβ诱导的毒性。近期，我们通过克隆表达获得一种重组荞麦谷氧还蛋白(recombinant buckwheat glutaredoxin, rbGrx)，并对其晶体结构进行解析。同时研究也发现，该小分子蛋白具有抗氧化和抗氧化应激的作用。为了深入研究并揭示rbGrx抗氧化应激与衰老的关系，本文采用衰老研究经典模型——秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans, C. elegans)，探讨rbGrx对衰老及衰老疾病阿尔兹海默症(Alzheimers disease，AD)中的具体功效，主要内容包括：
1、rbGrx对C.elegans寿命与健康寿命的影响
通过显微镜观察统计检测rbGrx对N2野生型线虫寿命的影响，结果显示，和未经rbGrx处理的对照组相比，1-4μMrbGrx能对虫体显著地以浓度依赖方式发挥延长寿命的显著效应；荧光显微结果显示，rbGrx能明显减少线虫衰老的一个典型指标——肠道褐脂质的积累；同时，rbGrx能显著改善虫体的行为学能力，如咽抽速率和运动能力等，表明rbGrx对线虫的健康寿命具有有益的影响。
2、rbGrx对C.elegans发挥有益影响的具体机制
通过胡桃醌和过氧化氢诱导氧化应激、高温诱导热应激、体外自由基检测、荧光探针法等方法检测显示，rbGrx可以增强线虫的抗热应激和抗氧化应激能力，增强线虫的胁迫耐受性；rbGrx明显降低线虫细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平，并通过去除ROS延长其寿命；rbGrx在体外能显著清除自由基，如DPPH，?OH和超氧化物体外阴离子自由基，并在正常培养条件和氧化应激条件下下调体内ROS水平；rbGrx可促进抗氧化酶的活性，包括超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性，过氧化氢酶(Catalase，CAT)活性和谷胱甘肽(Glutathione， GSH)含量，且上调体内GSH/GSSG比例。rbGrx清除自由基和上调抗氧化酶活性均可以导致细胞内ROS水平的减弱。降低细胞内ROS水平也可能导致压力耐受和延长寿命。有关rbGrx发挥作用的主要途径有待进一步探讨。
利用qRT-PCR方法检测和突变体线虫品系寿命检测显示，rbGrx发挥的抗氧化和抗衰老作用依赖于HSF-1，而非DAF-16和SKN-1。靶基因的上调进一步证实了HSF-1在rbGrx介导的寿命延长中的作用。IIS通路调节许多生物体的衰老，范围从简单的无脊椎动物到哺乳动物，包括人类。秀丽隐杆线虫模型通常用于研究IIS通路在衰老和长寿中的作用。本研究检测了IIS通路的两个关键元素：daf-2和age-1。结果表明rbGrx不依赖于IIS通路，rbGrx如何激活HSF-1需进一步探索。
3、rbGrx对衰老相关疾病AD的影响及其机制
阿尔兹海默症(Alzheimers disease，AD)与衰老息息相关，其病因迄今不明，一般认为其主要的特征性病理改变是β淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)沉积诱发的一系列病理毒性。研究表明Aβ沉积可通过抗衰物质降低。本研究通过检测rbGrx对AD模型线虫的作用，并通过显微观察法、荧光探针法、实时定量法、荧光染色等方法研究其作用机制，进而探究其对AD的具体功效。结果显示，1)rbGrx能够明显延长CL4176线虫的寿命，增强其运动能力，延迟其繁殖高峰期；2)rbGrx能够很好的减缓Aβ毒性诱导的CL4176线虫僵化速率，清除CL4176线虫体内ROS，增强内源性抗氧化酶防御系统，降低其体内Aβ积累，这与在N2野生型线虫中的作用基本一致。上述结果进一步表明，rbGrx以HSF-1依赖性的方式发挥其抗氧化和抗衰老效应，且rbGrx延缓衰老的效应可能对衰老疾病AD具有潜在的应用价值。
综上所述，本研究证明，rbGrx在正常和压力条件下均能延长线虫寿命可能归因于其直接清除ROS的作用和其间接地通过上调与压力相关转录因子HSF-1清除自由基的活性。同时，我们的研究揭示，rbGrx可能通过抵抗环境压力延长人类平均寿命。作为一种有效的抗氧化剂，rbGrx可能对人类衰老及与衰老相关的疾病具有很好的延缓作用。这些结果丰富了荞麦活性物质在衰老研究领域的应用，并为其深入的机理研究和应用研究打下了理论基础。
1、rbGrx对C.elegans寿命与健康寿命的影响
通过显微镜观察统计检测rbGrx对N2野生型线虫寿命的影响，结果显示，和未经rbGrx处理的对照组相比，1-4μMrbGrx能对虫体显著地以浓度依赖方式发挥延长寿命的显著效应；荧光显微结果显示，rbGrx能明显减少线虫衰老的一个典型指标——肠道褐脂质的积累；同时，rbGrx能显著改善虫体的行为学能力，如咽抽速率和运动能力等，表明rbGrx对线虫的健康寿命具有有益的影响。
2、rbGrx对C.elegans发挥有益影响的具体机制
通过胡桃醌和过氧化氢诱导氧化应激、高温诱导热应激、体外自由基检测、荧光探针法等方法检测显示，rbGrx可以增强线虫的抗热应激和抗氧化应激能力，增强线虫的胁迫耐受性；rbGrx明显降低线虫细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平，并通过去除ROS延长其寿命；rbGrx在体外能显著清除自由基，如DPPH，?OH和超氧化物体外阴离子自由基，并在正常培养条件和氧化应激条件下下调体内ROS水平；rbGrx可促进抗氧化酶的活性，包括超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性，过氧化氢酶(Catalase，CAT)活性和谷胱甘肽(Glutathione， GSH)含量，且上调体内GSH/GSSG比例。rbGrx清除自由基和上调抗氧化酶活性均可以导致细胞内ROS水平的减弱。降低细胞内ROS水平也可能导致压力耐受和延长寿命。有关rbGrx发挥作用的主要途径有待进一步探讨。
利用qRT-PCR方法检测和突变体线虫品系寿命检测显示，rbGrx发挥的抗氧化和抗衰老作用依赖于HSF-1，而非DAF-16和SKN-1。靶基因的上调进一步证实了HSF-1在rbGrx介导的寿命延长中的作用。IIS通路调节许多生物体的衰老，范围从简单的无脊椎动物到哺乳动物，包括人类。秀丽隐杆线虫模型通常用于研究IIS通路在衰老和长寿中的作用。本研究检测了IIS通路的两个关键元素：daf-2和age-1。结果表明rbGrx不依赖于IIS通路，rbGrx如何激活HSF-1需进一步探索。
3、rbGrx对衰老相关疾病AD的影响及其机制
阿尔兹海默症(Alzheimers disease，AD)与衰老息息相关，其病因迄今不明，一般认为其主要的特征性病理改变是β淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)沉积诱发的一系列病理毒性。研究表明Aβ沉积可通过抗衰物质降低。本研究通过检测rbGrx对AD模型线虫的作用，并通过显微观察法、荧光探针法、实时定量法、荧光染色等方法研究其作用机制，进而探究其对AD的具体功效。结果显示，1)rbGrx能够明显延长CL4176线虫的寿命，增强其运动能力，延迟其繁殖高峰期；2)rbGrx能够很好的减缓Aβ毒性诱导的CL4176线虫僵化速率，清除CL4176线虫体内ROS，增强内源性抗氧化酶防御系统，降低其体内Aβ积累，这与在N2野生型线虫中的作用基本一致。上述结果进一步表明，rbGrx以HSF-1依赖性的方式发挥其抗氧化和抗衰老效应，且rbGrx延缓衰老的效应可能对衰老疾病AD具有潜在的应用价值。
综上所述，本研究证明，rbGrx在正常和压力条件下均能延长线虫寿命可能归因于其直接清除ROS的作用和其间接地通过上调与压力相关转录因子HSF-1清除自由基的活性。同时，我们的研究揭示，rbGrx可能通过抵抗环境压力延长人类平均寿命。作为一种有效的抗氧化剂，rbGrx可能对人类衰老及与衰老相关的疾病具有很好的延缓作用。这些结果丰富了荞麦活性物质在衰老研究领域的应用，并为其深入的机理研究和应用研究打下了理论基础。