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飞蝗Locustamigratoria是世界性的重要农业害虫,具有迁飞性和暴发性,对农业生产造成巨大损失.细胞色素P450存在于细菌、原生生物、植物、真菌及动物等多种生物体内,参与生物体诸多重要的生命活动.细胞色素P450作为昆虫体内重要的解毒酶参与植物次生代谢物、杀虫剂等外源物质的代谢.本文利用RNAi、Real-timePCR、HPLC、UPLC-MS等多种生化和分子生物学理论和技术对飞蝗细胞色素P450进行了系统的研究,揭示了飞蝗细胞色素P450的表达特性及在拟除虫菊酯类杀虫剂中的代谢功能,探讨了飞蝗细胞色素P450对拟除虫菊酯类杀虫剂的解毒机制.主要研究结果如下:
一、飞蝗对拟除虫菊酯的敏感性分析及增效作用测定
采用点滴法测定飞蝗对不同剂量增效醚piperonylbutoxide(PBO)的敏感性;并在PBO预处理二龄飞蝗1h后,使用7-乙氧基香豆素(7-EC)作为底物测定了飞蝗细胞色素P450酶活性.实验结果表明,使用剂量为6.0μg/头的PBO点滴飞蝗后,死亡率约为6.6%,在此条件下飞蝗细胞色素P450酶活性被显著抑制.增效实验结果显示,PBO对溴氰菊酯、氟胺氰菊酯和氰戊菊酯的增效比分别是1.70、1.52、1.30倍,且在95%置信限无重叠,增效作用明显;而对氯菊酯的增效比为1.28,但在95%置信限发生重叠,增效作用不显著.由此推测,细胞色素P450在飞蝗对溴氰菊酯、氟胺氰菊酯和氰戊菊酯的解毒过程中发挥了作用.
二、飞蝗中肠细胞色素P450对拟除虫菊酯代谢机制研究
以飞蝗中肠作为研究材料,利用高效液相色谱技术(HPLC)开展了飞蝗中肠三种解毒酶对拟除虫菊酯类杀虫剂的代谢作用研究.结果显示,经三种解毒酶抑制剂(增效醚piperonylbutoxide(PBO)、磷酸三苯酯Triphenylphosphate(TPP)、顺丁烯二酸二乙酯Diethylmaleate(DEM))预处理过的飞蝗中肠与溴氰菊酯和氟胺氰菊酯反应后,PBO处理组剩余的溴氰菊酯和氟胺氰菊酯分别是对照组及DEM、TPP处理组的2.5-3倍,且DEM和TPP处理组与对照组相比无显著差异.经三种抑制剂预处理过的飞蝗中肠与氰戊菊酯和氯菊酯反应后,两种杀虫剂的剩余量与对照相比均无显著差异.表明中肠细胞色素P450是飞蝗代谢溴氰菊酯和氟胺氰菊酯的主要因素.
进一步采用超高效液相色谱—质谱联用(UPLC-MS)技术鉴定了飞蝗中肠溴氰菊酯的代谢产物为羟基化的溴氰菊酯,表明飞蝗中肠细胞色素P450可能通过芳香族羟基化作用参与溴氰菊酯代谢解毒.
三、细胞色素P450基因转录组构建及表达分析
我们利用Illumina测序技术构建飞蝗转录组,并通过关键词搜索和测序克隆,鉴定出飞蝗的71个细胞色素P450基因片段和78个细胞色素P450全长基因.利用最大似然法构建系统进化树,上述78个细胞色素P450全长基因,分别属于CYP4、CYP3、CYP2和线粒体clan,并可进一步细分为19个家族和43个亚家族.通过Real-timePCR技术分析了LmCYP在飞蝗13个不同组织部位及7个不同发育阶段的表达特征.结果表明多数LmCYP基因在若虫期和成虫期表达较高.LmCYP在飞蝗13个不同组织部位表达情况具有高度多样性.LmCYP在不同组织部位和不同发育阶段的表达模式多样性可能与飞蝗LmCYP基因功能的多样性密切相关.
四、两个LmCYP9A基因的表达特性及解毒功能分析
通过对飞蝗转录组数据库进行搜索,并采用反转录PCR(Reverse Transcription PCR,RT-PCR)克隆获得飞蝗两个LmCYP9A基因,其中LmCYP9AQ1的cDNA全长序列为1575bp,编码525个氨基酸;而LmCYP9A3的cDNA全长序列为1572bp,编码524个氨基酸.实时定量PCR(Real time-quantitative PCR,RT-qPCR)结果表明LmCYP9AQ1在脑中表达量最高,其次是脂肪体;LmCYP9A3在脂肪体中表达量最高,其次是胃盲囊和马氏管.对飞蝗不同发育阶段的表达进行检测,发现两个LmCYP9A基因在飞蝗整个发育阶段均有表达,LmCYP9AQ1与LmCYP9A3相比,在若虫期的表达量较高.利用RNAi(RNA interference)技术,分别沉默LmCYP9AQ1与LmCYP9A3后,对不同拟除虫菊酯类杀虫剂的敏感性进行测定,发现LmCYP9AQ1参与了氟胺氰菊酯的代谢解毒,而LmCYP9A3参与了溴氰菊酯和氯菊酯的代谢解毒.
五、两个LmCYP9A基因在飞蝗中肠中的解毒功能
本文使用五龄飞蝗中肠作为研究材料,采用离体组织培养方法结合RNAi技术对飞蝗中肠LmCYP9AQ1和LmCYP9A3基因进行干扰,再结合HPLC测定分析,研究了LmCYP9AQ1和LmCYP9A3与拟除虫菊酯类杀虫剂溴氰菊酯之间的代谢解毒关系.研究结果表明,飞蝗中肠可离体培养至少30小时,在添加靶标基因dsRNA24小时后,可将离体培养中肠内目的基因显著沉默.但在本研究实验结果未能证实上述两个LmCYP9A基因是否直接参与了离体培养中肠内拟除虫菊酯类杀虫剂的代谢解毒过程.本文成功建立了飞蝗离体组织培养方法,采用RNA干扰系统对LmCYP9AQ1和LmCYP9A3基因进行体外干扰实验,为其它细胞色素P450基因的代谢解毒研究提供参考.
综上所述,本文首先对飞蝗对拟除虫菊酯的敏感性及增效作用进行了测定,接着利用HPLC分析飞蝗中肠三种解毒酶对拟除虫菊酯类杀虫剂的代谢作用,进一步使用UPLC-MS获得溴氰菊酯通过细胞色素P450酶代谢后的产物;通过建立飞蝗转录组数据库,对飞蝗细胞色素P450的系统发育进行分析,采用Real-timePCR技术分析飞蝗细胞色素P450基因在飞蝗不同组织和不同发育阶段的表达特异性;结合Real-timePCR和RNAi技术研究飞蝗细胞色素P450基因的表达特性及对不同拟除虫菊酯类杀虫剂的解毒功能;成功建立了飞蝗中肠离体培养技术及RNAi组织培养技术.研究结果为进一步深入开展细胞色素P450基因的分子特性及功能研究提供基础资料和实践依据,对飞蝗防治中杀虫剂的科学施用具有一定的指导意义.
一、飞蝗对拟除虫菊酯的敏感性分析及增效作用测定
采用点滴法测定飞蝗对不同剂量增效醚piperonylbutoxide(PBO)的敏感性;并在PBO预处理二龄飞蝗1h后,使用7-乙氧基香豆素(7-EC)作为底物测定了飞蝗细胞色素P450酶活性.实验结果表明,使用剂量为6.0μg/头的PBO点滴飞蝗后,死亡率约为6.6%,在此条件下飞蝗细胞色素P450酶活性被显著抑制.增效实验结果显示,PBO对溴氰菊酯、氟胺氰菊酯和氰戊菊酯的增效比分别是1.70、1.52、1.30倍,且在95%置信限无重叠,增效作用明显;而对氯菊酯的增效比为1.28,但在95%置信限发生重叠,增效作用不显著.由此推测,细胞色素P450在飞蝗对溴氰菊酯、氟胺氰菊酯和氰戊菊酯的解毒过程中发挥了作用.
二、飞蝗中肠细胞色素P450对拟除虫菊酯代谢机制研究
以飞蝗中肠作为研究材料,利用高效液相色谱技术(HPLC)开展了飞蝗中肠三种解毒酶对拟除虫菊酯类杀虫剂的代谢作用研究.结果显示,经三种解毒酶抑制剂(增效醚piperonylbutoxide(PBO)、磷酸三苯酯Triphenylphosphate(TPP)、顺丁烯二酸二乙酯Diethylmaleate(DEM))预处理过的飞蝗中肠与溴氰菊酯和氟胺氰菊酯反应后,PBO处理组剩余的溴氰菊酯和氟胺氰菊酯分别是对照组及DEM、TPP处理组的2.5-3倍,且DEM和TPP处理组与对照组相比无显著差异.经三种抑制剂预处理过的飞蝗中肠与氰戊菊酯和氯菊酯反应后,两种杀虫剂的剩余量与对照相比均无显著差异.表明中肠细胞色素P450是飞蝗代谢溴氰菊酯和氟胺氰菊酯的主要因素.
进一步采用超高效液相色谱—质谱联用(UPLC-MS)技术鉴定了飞蝗中肠溴氰菊酯的代谢产物为羟基化的溴氰菊酯,表明飞蝗中肠细胞色素P450可能通过芳香族羟基化作用参与溴氰菊酯代谢解毒.
三、细胞色素P450基因转录组构建及表达分析
我们利用Illumina测序技术构建飞蝗转录组,并通过关键词搜索和测序克隆,鉴定出飞蝗的71个细胞色素P450基因片段和78个细胞色素P450全长基因.利用最大似然法构建系统进化树,上述78个细胞色素P450全长基因,分别属于CYP4、CYP3、CYP2和线粒体clan,并可进一步细分为19个家族和43个亚家族.通过Real-timePCR技术分析了LmCYP在飞蝗13个不同组织部位及7个不同发育阶段的表达特征.结果表明多数LmCYP基因在若虫期和成虫期表达较高.LmCYP在飞蝗13个不同组织部位表达情况具有高度多样性.LmCYP在不同组织部位和不同发育阶段的表达模式多样性可能与飞蝗LmCYP基因功能的多样性密切相关.
四、两个LmCYP9A基因的表达特性及解毒功能分析
通过对飞蝗转录组数据库进行搜索,并采用反转录PCR(Reverse Transcription PCR,RT-PCR)克隆获得飞蝗两个LmCYP9A基因,其中LmCYP9AQ1的cDNA全长序列为1575bp,编码525个氨基酸;而LmCYP9A3的cDNA全长序列为1572bp,编码524个氨基酸.实时定量PCR(Real time-quantitative PCR,RT-qPCR)结果表明LmCYP9AQ1在脑中表达量最高,其次是脂肪体;LmCYP9A3在脂肪体中表达量最高,其次是胃盲囊和马氏管.对飞蝗不同发育阶段的表达进行检测,发现两个LmCYP9A基因在飞蝗整个发育阶段均有表达,LmCYP9AQ1与LmCYP9A3相比,在若虫期的表达量较高.利用RNAi(RNA interference)技术,分别沉默LmCYP9AQ1与LmCYP9A3后,对不同拟除虫菊酯类杀虫剂的敏感性进行测定,发现LmCYP9AQ1参与了氟胺氰菊酯的代谢解毒,而LmCYP9A3参与了溴氰菊酯和氯菊酯的代谢解毒.
五、两个LmCYP9A基因在飞蝗中肠中的解毒功能
本文使用五龄飞蝗中肠作为研究材料,采用离体组织培养方法结合RNAi技术对飞蝗中肠LmCYP9AQ1和LmCYP9A3基因进行干扰,再结合HPLC测定分析,研究了LmCYP9AQ1和LmCYP9A3与拟除虫菊酯类杀虫剂溴氰菊酯之间的代谢解毒关系.研究结果表明,飞蝗中肠可离体培养至少30小时,在添加靶标基因dsRNA24小时后,可将离体培养中肠内目的基因显著沉默.但在本研究实验结果未能证实上述两个LmCYP9A基因是否直接参与了离体培养中肠内拟除虫菊酯类杀虫剂的代谢解毒过程.本文成功建立了飞蝗离体组织培养方法,采用RNA干扰系统对LmCYP9AQ1和LmCYP9A3基因进行体外干扰实验,为其它细胞色素P450基因的代谢解毒研究提供参考.
综上所述,本文首先对飞蝗对拟除虫菊酯的敏感性及增效作用进行了测定,接着利用HPLC分析飞蝗中肠三种解毒酶对拟除虫菊酯类杀虫剂的代谢作用,进一步使用UPLC-MS获得溴氰菊酯通过细胞色素P450酶代谢后的产物;通过建立飞蝗转录组数据库,对飞蝗细胞色素P450的系统发育进行分析,采用Real-timePCR技术分析飞蝗细胞色素P450基因在飞蝗不同组织和不同发育阶段的表达特异性;结合Real-timePCR和RNAi技术研究飞蝗细胞色素P450基因的表达特性及对不同拟除虫菊酯类杀虫剂的解毒功能;成功建立了飞蝗中肠离体培养技术及RNAi组织培养技术.研究结果为进一步深入开展细胞色素P450基因的分子特性及功能研究提供基础资料和实践依据,对飞蝗防治中杀虫剂的科学施用具有一定的指导意义.