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肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是世界上常见的、病死率较高的一种原发性肝癌，肝癌细胞的扩散、侵袭和转移是肝癌患者死亡的主要原因。但是对于肝癌发生发展和转移的机制目前尚不清楚。因此，阐明肝癌发生发展的原因及其机制，进而发现新的手段提高治疗效果，延长患者生存期的作用。目前有越来越多的研究集中在探讨肿瘤微环境对肝癌发生发展的机制研究。
内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是指细胞内质网由于某些原因导致生理功能发生紊乱，钙稳态失衡，错误折叠或未折叠的蛋白质在内质网腔内聚集的一种亚细胞器的病理状态，它可使错误折叠的蛋白质恢复正确构象并能够进一步加工所必需的步骤，是一种细胞自我保护的机制。肿瘤细胞在生长、浸润和转移过程中所经历的缺血、缺氧、营养剥夺等多种环境压力会对肿瘤细胞造成内质网应激，为克服内质网应激，肿瘤细胞会诱发细胞产生未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR），通过内质网相关的降解、自噬等方式维持自身稳定并促进肿瘤的生存、进展和转移，同时，肿瘤细胞还可通过UPR适应并改变生存微环境，引发炎症并影响抗原提呈，从而抵抗机体免疫系统的攻击，促进肿瘤细胞的免疫逃逸。因此，阐明肿瘤细胞的内质网应激与肿瘤微环境之间的关系，并探讨其可能的机制，为肝癌的临床治疗提供理论基础，最终达到提高治疗效果，延长患者生存期的作用。
巨噬细胞是肿瘤微环境中的重要组成部分，且肿瘤微环境中的巨噬细胞在多种因素的作用下常常发生表型变化转变为肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM），进而发挥促进肿瘤增殖、侵袭迁移等有利于肿瘤进展的作用。有研究报道，将内质网应激状态下的肿瘤细胞的上清液与巨噬细胞共同孵育，发现巨噬细胞可分泌多种炎症因子，那么内质网应激状态下的肿瘤细胞是如何将信号传递给巨噬细胞，促进炎症因子的产生？外泌体（Exosome）是一类直径大约为40-100nm的圆形或类圆形囊泡样结构，在细胞间信号传递中发挥着重要作用。因此，以Exosome为媒介，探讨内质网应激状态下肝癌细胞能否影响巨噬细胞的功能及并探讨其可能的分子机制，对此进行深入研究，不仅可以深化对内质网应激在肿瘤作用中的认识,还可以为治疗HCC提供新的靶点。
目的：
通过将处于ERS状态与未ERS的肝癌细胞释放的exosome与小鼠巨噬细胞共培养或注射于裸鼠细胞尾静脉，观察小鼠巨噬细胞炎症因子的表达状况，同时收集裸鼠腹腔巨噬细胞，检测其炎症因子的表达，以期了解内质网应激状态下的肝癌细胞对小鼠巨噬细胞炎症因子表达的影响。同时探讨肝癌细胞内质网应激释放的exosome对小鼠巨噬细胞炎症因子表达的机制研究。
方法：
（1）采用组织芯片技术，免疫组织化学方法观察肝癌组织内质网应激标志蛋白GRP78的表达与临床病理特征的关系。
（2）采用组织芯片技术，免疫组织化学方法观察肝癌组织内质网应激标志蛋白GRP78的表达情况及与巨噬细胞标志性蛋白CD68表达的相关性研究。
（3）将不同浓度的（1.5μM、3μM和6μM）衣霉素（TM，Tunicamycin）作用于肝癌细胞HepG224小时后，采用Western-Blot方法检测内质网应激标志性蛋白GRP78的表达变化，将3μM的TM作用肝癌细胞HepG2不同时间（0h，3h，6h，12h，24h，48h）后，采用Western-Blot方法检测内质网应激标志性蛋白GRP78的表达变化。
（4）将3μM的TM作用人肝癌细胞Bel-7402和人肺癌细胞A54924h后采用Western-Blot方法检测内质网应激标志性蛋白GRP78的表达变化。
（5）将3μM的TM作用于人肝癌细胞HepG224小时后，分别收集TM处理组（Exo-TM）与未处理组细胞（Exo-con）的上清液，使用ExoQuick-TC试剂盒提取各组exosome，透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope,TEM）观察exosome的形态及大小，Western-Blot方法检测exosomes标志性蛋白CD63的表达。
（6）使用膜染料PKH67标记exosome，将PKH67标记的exosomes与小鼠巨噬细胞RAW264.7共同孵育12h后，使用共聚焦显微镜观察小鼠巨噬细胞吞噬exosome的情况。
（7）将不同的处理组的exosome（Exo-con和Exo-TM）与小鼠RAW264.7巨噬细胞共同孵育24小时，分别收集细胞和上清液，使用小鼠CBA细胞因子试剂盒检测炎症因子表达。
（8）分别对裸鼠尾静脉注射100μl的PBS、Exo-con和Exo-TM，隔日一次，共10次。注射结束后24h处死裸鼠，收集裸鼠腹腔巨噬细胞，小鼠CBA细胞因子试剂盒检测炎症因子的表达。
（9）将不同的处理组的exosome（Exo-con和Exo-TM）与小鼠巨噬细胞RAW264.7共同孵育24小时，Western-Blot方法检测小鼠巨噬细胞中STAT3蛋白的表达。（10）将不同的处理组的exosome（Exo-con和Exo-TM）与小鼠巨噬细胞RAW264.7或人共同孵育24小时，使用STAT3抑制剂S3I-201抑制小鼠巨噬细胞中p-STAT3中的表达，Western-Blot方法检测p-STAT3蛋白的表达，小鼠CBA细胞因子试剂盒检测炎症因子的表达
结果：
（1）肝癌组织内质网应激标志蛋白GRP78与患者临床病理特征的关系。肝癌组织中GRP78的阳性率分别为81.4％，GRP78的表达与肿瘤大小、临床分期相关(p＜0.05)，而与性别、年龄、肝炎病史、AFP、肝功能、肿瘤分化程度无关(p＞0.05)。
（2）巨噬细胞标志性蛋白CD68的平均阳性表达率为44±5.66%，肝癌组织内质网应激标志蛋白GRP78与巨噬细胞标志性蛋白CD68的表达呈相关性(Z/t=-3.300，P<0.01)。
（3）内质网应激诱导剂TM可上调人肝癌细胞HepG2内质网应激标志蛋白GRP78的表达，并呈浓度依赖性，使用3μM的TM浓度作用于肝癌细胞HepG224h，与6μM作用于肝癌细胞GRP78的表达无显著性差异(p＞0.05)；3μM浓度的TM与肝癌细胞共培养（0h，3h，6h，12h，24h，48h），随着作用时间的延长，GRP78蛋白的表达逐渐增加，但24h与48h结果无显著差异(p＞0.05)。
（4）使用Western-Blot法检测结果显示浓度3μM的TM均可可诱导人肝癌细胞Bel-7402和人肺癌细胞A549中的GRP78蛋白的表达。
（5）使用透射电镜观察到收集到的“exosome”呈圆形或类圆形膜性囊泡样结构，直径约为40-100nm，符合exosome的典型特征。Western-Blot检测显示收集的“exosome”均表达exosome标记物蛋白CD63，但无内质网分子伴侣蛋白Calnexin的表达，表明上清中收集到的是不含细胞成分的exosome。
（6）使用激光共聚焦显微镜技术显示，PKH67标记的exosomes能够被小鼠巨噬细胞RAW264.7所摄取。
（7）炎症因子检测结果显示，Exo-con和Exo-TM均可上调小鼠巨噬细胞RAW264.7的IL-6，IL-10，MCF-1,炎症因子的表达，且exo-TM的作用更加明显。
（8）将Exo-con和Exo-TM通过尾静脉注射到裸鼠体内，收集裸鼠腹腔巨噬细胞，细胞上清中的IL-6，IL-10，MCP-1，TNF-α炎症因子的表达也明显升高。
（9）Western-Blot检测显示Exo-TM作用于小鼠巨噬细胞RAW264.724小时后可显著升高p-STAT3的表达水平。
（10）Western-Blot检测显示使用STAT3抑制剂S3I-201可抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7中p-STAT3表达，同时可下调Exo-TM对小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症因子的释放。
结论：
(1)内质网应激可促进肝癌细胞分泌exosome。
(2)内质网应激状态下的肝癌细胞释放的exosome能够被小鼠巨噬细胞吞噬摄取，并可上调炎症因子表达。
(3)内质网应激状态下的肝癌细胞释放的exosome通过STAT3调节小鼠巨噬细胞炎症因子的表达。
内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是指细胞内质网由于某些原因导致生理功能发生紊乱，钙稳态失衡，错误折叠或未折叠的蛋白质在内质网腔内聚集的一种亚细胞器的病理状态，它可使错误折叠的蛋白质恢复正确构象并能够进一步加工所必需的步骤，是一种细胞自我保护的机制。肿瘤细胞在生长、浸润和转移过程中所经历的缺血、缺氧、营养剥夺等多种环境压力会对肿瘤细胞造成内质网应激，为克服内质网应激，肿瘤细胞会诱发细胞产生未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR），通过内质网相关的降解、自噬等方式维持自身稳定并促进肿瘤的生存、进展和转移，同时，肿瘤细胞还可通过UPR适应并改变生存微环境，引发炎症并影响抗原提呈，从而抵抗机体免疫系统的攻击，促进肿瘤细胞的免疫逃逸。因此，阐明肿瘤细胞的内质网应激与肿瘤微环境之间的关系，并探讨其可能的机制，为肝癌的临床治疗提供理论基础，最终达到提高治疗效果，延长患者生存期的作用。
巨噬细胞是肿瘤微环境中的重要组成部分，且肿瘤微环境中的巨噬细胞在多种因素的作用下常常发生表型变化转变为肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM），进而发挥促进肿瘤增殖、侵袭迁移等有利于肿瘤进展的作用。有研究报道，将内质网应激状态下的肿瘤细胞的上清液与巨噬细胞共同孵育，发现巨噬细胞可分泌多种炎症因子，那么内质网应激状态下的肿瘤细胞是如何将信号传递给巨噬细胞，促进炎症因子的产生？外泌体（Exosome）是一类直径大约为40-100nm的圆形或类圆形囊泡样结构，在细胞间信号传递中发挥着重要作用。因此，以Exosome为媒介，探讨内质网应激状态下肝癌细胞能否影响巨噬细胞的功能及并探讨其可能的分子机制，对此进行深入研究，不仅可以深化对内质网应激在肿瘤作用中的认识,还可以为治疗HCC提供新的靶点。
目的：
通过将处于ERS状态与未ERS的肝癌细胞释放的exosome与小鼠巨噬细胞共培养或注射于裸鼠细胞尾静脉，观察小鼠巨噬细胞炎症因子的表达状况，同时收集裸鼠腹腔巨噬细胞，检测其炎症因子的表达，以期了解内质网应激状态下的肝癌细胞对小鼠巨噬细胞炎症因子表达的影响。同时探讨肝癌细胞内质网应激释放的exosome对小鼠巨噬细胞炎症因子表达的机制研究。
方法：
（1）采用组织芯片技术，免疫组织化学方法观察肝癌组织内质网应激标志蛋白GRP78的表达与临床病理特征的关系。
（2）采用组织芯片技术，免疫组织化学方法观察肝癌组织内质网应激标志蛋白GRP78的表达情况及与巨噬细胞标志性蛋白CD68表达的相关性研究。
（3）将不同浓度的（1.5μM、3μM和6μM）衣霉素（TM，Tunicamycin）作用于肝癌细胞HepG224小时后，采用Western-Blot方法检测内质网应激标志性蛋白GRP78的表达变化，将3μM的TM作用肝癌细胞HepG2不同时间（0h，3h，6h，12h，24h，48h）后，采用Western-Blot方法检测内质网应激标志性蛋白GRP78的表达变化。
（4）将3μM的TM作用人肝癌细胞Bel-7402和人肺癌细胞A54924h后采用Western-Blot方法检测内质网应激标志性蛋白GRP78的表达变化。
（5）将3μM的TM作用于人肝癌细胞HepG224小时后，分别收集TM处理组（Exo-TM）与未处理组细胞（Exo-con）的上清液，使用ExoQuick-TC试剂盒提取各组exosome，透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope,TEM）观察exosome的形态及大小，Western-Blot方法检测exosomes标志性蛋白CD63的表达。
（6）使用膜染料PKH67标记exosome，将PKH67标记的exosomes与小鼠巨噬细胞RAW264.7共同孵育12h后，使用共聚焦显微镜观察小鼠巨噬细胞吞噬exosome的情况。
（7）将不同的处理组的exosome（Exo-con和Exo-TM）与小鼠RAW264.7巨噬细胞共同孵育24小时，分别收集细胞和上清液，使用小鼠CBA细胞因子试剂盒检测炎症因子表达。
（8）分别对裸鼠尾静脉注射100μl的PBS、Exo-con和Exo-TM，隔日一次，共10次。注射结束后24h处死裸鼠，收集裸鼠腹腔巨噬细胞，小鼠CBA细胞因子试剂盒检测炎症因子的表达。
（9）将不同的处理组的exosome（Exo-con和Exo-TM）与小鼠巨噬细胞RAW264.7共同孵育24小时，Western-Blot方法检测小鼠巨噬细胞中STAT3蛋白的表达。（10）将不同的处理组的exosome（Exo-con和Exo-TM）与小鼠巨噬细胞RAW264.7或人共同孵育24小时，使用STAT3抑制剂S3I-201抑制小鼠巨噬细胞中p-STAT3中的表达，Western-Blot方法检测p-STAT3蛋白的表达，小鼠CBA细胞因子试剂盒检测炎症因子的表达
结果：
（1）肝癌组织内质网应激标志蛋白GRP78与患者临床病理特征的关系。肝癌组织中GRP78的阳性率分别为81.4％，GRP78的表达与肿瘤大小、临床分期相关(p＜0.05)，而与性别、年龄、肝炎病史、AFP、肝功能、肿瘤分化程度无关(p＞0.05)。
（2）巨噬细胞标志性蛋白CD68的平均阳性表达率为44±5.66%，肝癌组织内质网应激标志蛋白GRP78与巨噬细胞标志性蛋白CD68的表达呈相关性(Z/t=-3.300，P<0.01)。
（3）内质网应激诱导剂TM可上调人肝癌细胞HepG2内质网应激标志蛋白GRP78的表达，并呈浓度依赖性，使用3μM的TM浓度作用于肝癌细胞HepG224h，与6μM作用于肝癌细胞GRP78的表达无显著性差异(p＞0.05)；3μM浓度的TM与肝癌细胞共培养（0h，3h，6h，12h，24h，48h），随着作用时间的延长，GRP78蛋白的表达逐渐增加，但24h与48h结果无显著差异(p＞0.05)。
（4）使用Western-Blot法检测结果显示浓度3μM的TM均可可诱导人肝癌细胞Bel-7402和人肺癌细胞A549中的GRP78蛋白的表达。
（5）使用透射电镜观察到收集到的“exosome”呈圆形或类圆形膜性囊泡样结构，直径约为40-100nm，符合exosome的典型特征。Western-Blot检测显示收集的“exosome”均表达exosome标记物蛋白CD63，但无内质网分子伴侣蛋白Calnexin的表达，表明上清中收集到的是不含细胞成分的exosome。
（6）使用激光共聚焦显微镜技术显示，PKH67标记的exosomes能够被小鼠巨噬细胞RAW264.7所摄取。
（7）炎症因子检测结果显示，Exo-con和Exo-TM均可上调小鼠巨噬细胞RAW264.7的IL-6，IL-10，MCF-1,炎症因子的表达，且exo-TM的作用更加明显。
（8）将Exo-con和Exo-TM通过尾静脉注射到裸鼠体内，收集裸鼠腹腔巨噬细胞，细胞上清中的IL-6，IL-10，MCP-1，TNF-α炎症因子的表达也明显升高。
（9）Western-Blot检测显示Exo-TM作用于小鼠巨噬细胞RAW264.724小时后可显著升高p-STAT3的表达水平。
（10）Western-Blot检测显示使用STAT3抑制剂S3I-201可抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7中p-STAT3表达，同时可下调Exo-TM对小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症因子的释放。
结论：
(1)内质网应激可促进肝癌细胞分泌exosome。
(2)内质网应激状态下的肝癌细胞释放的exosome能够被小鼠巨噬细胞吞噬摄取，并可上调炎症因子表达。
(3)内质网应激状态下的肝癌细胞释放的exosome通过STAT3调节小鼠巨噬细胞炎症因子的表达。