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背景与目的：
心脏骤停、急性心力衰竭、休克等全身血液动力学变化可引起急性全脑缺血事件。脑缺血后引起的神经系统损伤涉及多种病理过程，如兴奋性氨基酸异常增多、氧/氮活性物质产生过多、钙离子超载等。其中，兴奋性氨基酸毒性是脑缺血损伤的主要机制之一。我们先前的研究发现，成年大鼠全脑缺血10min前间隔1-4d,予8%的低氧预处理(hypoxic preconditioning, HPC)30-120min，可以明显减轻短暂全脑缺血(transient global cerebral ischemia，tGCI)后海马CA1区的神经元死亡，其中缺血前间隔1d，予8%的低氧预处理30min所起的神经保护作用最显著。然而，低氧预处理在脑缺血后发挥神经保护作用的机制尚未完全清楚。本研究在已建立的大鼠低氧预处理tGCI模型中，观察大鼠海马CA1区胞外谷氨酸水平、谷氨酸转运体-1(glial glutamate transporter-1, GLT-1)、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)、缝隙连接蛋白43(connexin 43, Cx43)、原癌基因酪氨酸蛋白激酶(proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src，c-Src)的表达变化，进一步探讨低氧预处理是否通过调节Cx43/c-Src通路,上调GLT-1及GS，降低缺血后的谷氨酸水平，从而对tGCI后成年大鼠发挥神经保护作用。
材料与方法：
本研究采用体重为220～280g的成年雄性Wistar大鼠，根据Pulsinelli经典的四血管闭塞方法进行改良后制作短暂全脑缺血模型。大鼠tGCI10min前1d给予HPC，即将大鼠放入密闭防潮箱内连续通入8％O2+92％N2混合气体30min。通过微量透析方法分别观察假手术(Sham)组、tGCI组及低氧预处理-短暂全脑缺血(HPC)组大鼠海马CA1区谷氨酸水平。通过Westernblotting技术检测Sham组、tGCI组、HPC组在不同时间点海马CA1区GLT-1、GS、Cx43及c-Src的蛋白表达。使用GS活性试剂盒检测Sham组、tGCI组、HPC组在不同时间点海马CA1区GS活性。通过免疫组化、免疫荧光双标技术观察Sham组、tGCI组及HPC组在不同时间点大鼠海马CA1区GLT-1、p-c-Src在细胞内的定位。
在大鼠HPC前30min，经侧脑室注射GLT-1抑制剂双氢红藻氨酸盐(Dihydrokainate，DHK)，在缺血再灌注7d，分别通过Westernblotting和尼氏染色、神经元特异性核蛋白(Neuron-specific nuclear protein，NeuN)免疫组化、Fluoro-JadeB(FJ-B)染色，检测海马CA1区GLT-1蛋白表达和神经元的改变。在大鼠HPC前30min，经腹腔注射GS活性抑制剂蛋氨酸亚砜胺(Methionine sulfoximine, MSO)，在再灌注后4h，通过Westernblotting检测海马CA1区GS活性和GLT-1表达。在大鼠HPC前30min，经侧脑室注射缝隙连接蛋白模拟肽(Connexin Mimetic，Gap26)，在再灌注后4h，通过Westernblotting，分别检测海马CA1区Cx43,p-c-Src,GLT-1表达和GS活性。在大鼠tGCI前24h，经侧脑室注射4-氨基-5-(4-氯苯基)-7-(叔丁基)吡唑并嘧啶(4-amino-5-(4-chlorophenyl)-7-(t-butyl)pyrazolo(3,4-d)pyrimidine,PP2)，在再灌注后4h，通过Westernblotting，分别检测海马CA1区p-c-Src,Cx43,GLT-1表达和GS活性。
结果：
1.与Sham组相比，tGCI组海马CA1区胞外谷氨酸浓度在缺血再灌注0h开始升高，缺血后4-24h迅速增高，于24h达高峰，48h出现下降，但仍高于Sham组(p＜0.05)。与tGCI组比较，HPC组海马CA1区胞外谷氨酸浓度在缺血再灌注0h先升高，4-24h后逐渐下降，24-48h出现轻微升高，但仍低于tGCI组(p＜0.05)。
2.与Sham组比较，大鼠海马CA1区GLT-1的表达在tGCI后4h、24h、48h明显降低(p＜0.05)；在HPC组，与相对应的缺血再灌注4h、24h比较，GLT-1表达明显升高(p＜0.05)。免疫荧光双标结果显示，tGCI后7d在海马CA1区GLT-1主要与星形胶质细胞标志物GFAP共表达。在HPC前30min经侧脑室注射DHK，可使大鼠在缺血再灌注7d海马CA1区存活的神经元明显减少，变性的神经元数量增加(p＜0.05)。
3.与Sham组比较，tGCI组及HPC组各时间点大鼠海马CA1区GS蛋白表达均无明显变化(p＞0.05)。与Sham组相比，tGCI再灌注4h后GS活性明显减弱(p＜0.05)，而tGCI后再灌注0h，24h及48h后GS活性变化不明显(p＞0.05)。与tGCI组比较，HPC组GS活性在再灌注4h明显增强(p＜0.05)。在大鼠低氧前30min，经侧脑室注射GLT-1抑制剂DHK可以使HPC后海马CA1区GS活性降低(p＜0.05)。在大鼠低氧前30min腹腔注射GS抑制剂MSO不影响HPC后海马CA1区GLT-1的表达(p＞0.05)。
4、与Sham组比较，在tGCI后再灌注4h、24h，大鼠海马CA1区Cx43表达显著降低；在HPC组，与相对应的缺血再灌注4h、24h比较，Cx43表达明显增加。与Sham组比较，在tGCI后再灌注4h、24h、48h，大鼠海马CA1区p-c-Src表达明显增加(p＜0.05)，并于4h达高峰；在HPC组，与相对应的缺血再灌注4h、24h、48h比较，p-c-Src表达明显减少(p＜0.05)。免疫荧光双标结果显示，tGCI后再灌注7d在海马CA1区p-c-Src与星形胶质细胞标志物GFAP及小胶质细胞标志物Iba-1均有共表达。
5、与HPC4h比较，在大鼠HPC前30min，经侧脑室注射Cx43抑制剂Gap26可以使HPC后再灌注4h海马CA1区Cx43表达显著降低和p-c-Src表达明显升高(p＜0.05)。与tGCI4h比较，在大鼠tGCI前24h，经侧脑室注射p-c-Src抑制剂PP2可以使tGCI后再灌注4h海马CA1区p-c-Src表达降低和Cx43表达明显升高(p＜0.05)。
6、与HPC4h比较，在大鼠HPC前30min，经侧脑室注射Cx43抑制剂Gap26可以使HPC后再灌注4h海马CA1区GLT-1表达升高(p＜0.05)，而不影响GS活性(p?0.05)。与tGCI4h比较，在大鼠tGCI前24h，经侧脑室注射p-c-Src抑制剂PP2可以使tGCI后再灌注4h海马CA1区GLT-1表达和GS活性均显著降低(p＜0.05)。
结论
我们的研究结果表明低氧预处理通过介导Cx43/c-Src信号通路，增加大鼠海马CA1区GLT-1的表达，升高GS活性，降低胞外谷氨酸浓度，从而对成年大鼠tGCI发挥神经保护作用。
心脏骤停、急性心力衰竭、休克等全身血液动力学变化可引起急性全脑缺血事件。脑缺血后引起的神经系统损伤涉及多种病理过程，如兴奋性氨基酸异常增多、氧/氮活性物质产生过多、钙离子超载等。其中，兴奋性氨基酸毒性是脑缺血损伤的主要机制之一。我们先前的研究发现，成年大鼠全脑缺血10min前间隔1-4d,予8%的低氧预处理(hypoxic preconditioning, HPC)30-120min，可以明显减轻短暂全脑缺血(transient global cerebral ischemia，tGCI)后海马CA1区的神经元死亡，其中缺血前间隔1d，予8%的低氧预处理30min所起的神经保护作用最显著。然而，低氧预处理在脑缺血后发挥神经保护作用的机制尚未完全清楚。本研究在已建立的大鼠低氧预处理tGCI模型中，观察大鼠海马CA1区胞外谷氨酸水平、谷氨酸转运体-1(glial glutamate transporter-1, GLT-1)、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)、缝隙连接蛋白43(connexin 43, Cx43)、原癌基因酪氨酸蛋白激酶(proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src，c-Src)的表达变化，进一步探讨低氧预处理是否通过调节Cx43/c-Src通路,上调GLT-1及GS，降低缺血后的谷氨酸水平，从而对tGCI后成年大鼠发挥神经保护作用。
材料与方法：
本研究采用体重为220～280g的成年雄性Wistar大鼠，根据Pulsinelli经典的四血管闭塞方法进行改良后制作短暂全脑缺血模型。大鼠tGCI10min前1d给予HPC，即将大鼠放入密闭防潮箱内连续通入8％O2+92％N2混合气体30min。通过微量透析方法分别观察假手术(Sham)组、tGCI组及低氧预处理-短暂全脑缺血(HPC)组大鼠海马CA1区谷氨酸水平。通过Westernblotting技术检测Sham组、tGCI组、HPC组在不同时间点海马CA1区GLT-1、GS、Cx43及c-Src的蛋白表达。使用GS活性试剂盒检测Sham组、tGCI组、HPC组在不同时间点海马CA1区GS活性。通过免疫组化、免疫荧光双标技术观察Sham组、tGCI组及HPC组在不同时间点大鼠海马CA1区GLT-1、p-c-Src在细胞内的定位。
在大鼠HPC前30min，经侧脑室注射GLT-1抑制剂双氢红藻氨酸盐(Dihydrokainate，DHK)，在缺血再灌注7d，分别通过Westernblotting和尼氏染色、神经元特异性核蛋白(Neuron-specific nuclear protein，NeuN)免疫组化、Fluoro-JadeB(FJ-B)染色，检测海马CA1区GLT-1蛋白表达和神经元的改变。在大鼠HPC前30min，经腹腔注射GS活性抑制剂蛋氨酸亚砜胺(Methionine sulfoximine, MSO)，在再灌注后4h，通过Westernblotting检测海马CA1区GS活性和GLT-1表达。在大鼠HPC前30min，经侧脑室注射缝隙连接蛋白模拟肽(Connexin Mimetic，Gap26)，在再灌注后4h，通过Westernblotting，分别检测海马CA1区Cx43,p-c-Src,GLT-1表达和GS活性。在大鼠tGCI前24h，经侧脑室注射4-氨基-5-(4-氯苯基)-7-(叔丁基)吡唑并嘧啶(4-amino-5-(4-chlorophenyl)-7-(t-butyl)pyrazolo(3,4-d)pyrimidine,PP2)，在再灌注后4h，通过Westernblotting，分别检测海马CA1区p-c-Src,Cx43,GLT-1表达和GS活性。
结果：
1.与Sham组相比，tGCI组海马CA1区胞外谷氨酸浓度在缺血再灌注0h开始升高，缺血后4-24h迅速增高，于24h达高峰，48h出现下降，但仍高于Sham组(p＜0.05)。与tGCI组比较，HPC组海马CA1区胞外谷氨酸浓度在缺血再灌注0h先升高，4-24h后逐渐下降，24-48h出现轻微升高，但仍低于tGCI组(p＜0.05)。
2.与Sham组比较，大鼠海马CA1区GLT-1的表达在tGCI后4h、24h、48h明显降低(p＜0.05)；在HPC组，与相对应的缺血再灌注4h、24h比较，GLT-1表达明显升高(p＜0.05)。免疫荧光双标结果显示，tGCI后7d在海马CA1区GLT-1主要与星形胶质细胞标志物GFAP共表达。在HPC前30min经侧脑室注射DHK，可使大鼠在缺血再灌注7d海马CA1区存活的神经元明显减少，变性的神经元数量增加(p＜0.05)。
3.与Sham组比较，tGCI组及HPC组各时间点大鼠海马CA1区GS蛋白表达均无明显变化(p＞0.05)。与Sham组相比，tGCI再灌注4h后GS活性明显减弱(p＜0.05)，而tGCI后再灌注0h，24h及48h后GS活性变化不明显(p＞0.05)。与tGCI组比较，HPC组GS活性在再灌注4h明显增强(p＜0.05)。在大鼠低氧前30min，经侧脑室注射GLT-1抑制剂DHK可以使HPC后海马CA1区GS活性降低(p＜0.05)。在大鼠低氧前30min腹腔注射GS抑制剂MSO不影响HPC后海马CA1区GLT-1的表达(p＞0.05)。
4、与Sham组比较，在tGCI后再灌注4h、24h，大鼠海马CA1区Cx43表达显著降低；在HPC组，与相对应的缺血再灌注4h、24h比较，Cx43表达明显增加。与Sham组比较，在tGCI后再灌注4h、24h、48h，大鼠海马CA1区p-c-Src表达明显增加(p＜0.05)，并于4h达高峰；在HPC组，与相对应的缺血再灌注4h、24h、48h比较，p-c-Src表达明显减少(p＜0.05)。免疫荧光双标结果显示，tGCI后再灌注7d在海马CA1区p-c-Src与星形胶质细胞标志物GFAP及小胶质细胞标志物Iba-1均有共表达。
5、与HPC4h比较，在大鼠HPC前30min，经侧脑室注射Cx43抑制剂Gap26可以使HPC后再灌注4h海马CA1区Cx43表达显著降低和p-c-Src表达明显升高(p＜0.05)。与tGCI4h比较，在大鼠tGCI前24h，经侧脑室注射p-c-Src抑制剂PP2可以使tGCI后再灌注4h海马CA1区p-c-Src表达降低和Cx43表达明显升高(p＜0.05)。
6、与HPC4h比较，在大鼠HPC前30min，经侧脑室注射Cx43抑制剂Gap26可以使HPC后再灌注4h海马CA1区GLT-1表达升高(p＜0.05)，而不影响GS活性(p?0.05)。与tGCI4h比较，在大鼠tGCI前24h，经侧脑室注射p-c-Src抑制剂PP2可以使tGCI后再灌注4h海马CA1区GLT-1表达和GS活性均显著降低(p＜0.05)。
结论
我们的研究结果表明低氧预处理通过介导Cx43/c-Src信号通路，增加大鼠海马CA1区GLT-1的表达，升高GS活性，降低胞外谷氨酸浓度，从而对成年大鼠tGCI发挥神经保护作用。