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目的和意义氟牙症是牙齿发育过程中人体摄入过量的氟所引起的釉质缺损的一类疾病。虽然氟牙症的病因已经明确,但是其发病机制仍存在争议。目前对于这些机制的研究主要集中在两个方面:对成釉细胞的直接影响和对正在形成的基质的间接影响。氟对成釉细胞的直接影响主要集中在三个方面。首先,对细胞增殖来说,氟是一把双刃剑。微摩尔浓度级别的氟能够促进成釉细胞的增殖,而毫摩尔浓度级别的氟却能够抑制其增殖。其次,氟可通过丝裂原活化蛋白激酶途径调节成釉细胞的分化。第三,高氟可通过氧化应激及内质网应激的方式促进成釉细胞的凋亡。就间接影响而言,氟可能会干扰成釉细胞中釉质基质蛋白的合成、分泌和细胞内转运。此外,氟还能影响成釉细胞内外的pH值,从而影响成釉细胞的结构和功能。然而,目前关于氟是如何进入成釉细胞引起一系列应激反应的机理仍不清楚。本课题旨在研究氟离子进入成釉细胞的过程。因此,本课题拟以分泌期和成熟期的成釉细胞为研究对象,对其进行高氟处理,利用新型氟离子荧光探针检测高氟处理后细胞内氟离子浓度的变化;同时利用RT-qPCR和Western Blot实验检测高氟处理后成釉细胞TGF-β1的表达情况以及氯离子通道蛋白ClC-5、ClC-7及CFTR的表达情况;然后通过检测外源性的TGF-β1及其受体抑制剂对成釉细胞氯离子通道蛋白ClC-5、ClC-7及CFTR表达的影响,探寻高氟调节成釉细胞氯离子通道蛋白ClC-5、ClC-7及CFTR表达的可能机制,为预防氟牙症发生寻找新的方向。方法1以分泌期和成熟期的成釉细胞为研究对象,经过高氟处理后,利用新型氟离子探针,通过激光扫描共聚焦显微镜观察细胞内氟离子的积聚情况;并通过RT-qPCR和Western Blot实验,检测高氟环境下成釉细胞TGF-β1 mRNA和蛋白的表达情况。2将分泌期和成熟期的成釉细胞接种于培养皿中,经过高氟处理后,通过RT-qPCR和Western Blot实验,检测高氟环境下成釉细胞ClC-5、ClC-7及CFTR mRNA和蛋白的表达情况。3将分泌期和成熟期的成釉细胞接种于培养皿中,分别依据下面条件进行分组处理:对照组、高氟组、TGF-β1组、氟+TGF-β1组、TGF-β1+LY2157299组,通过RT-qPCR实验,检测不同条件下成釉细胞ClC-5、ClC-7及CFTR mRNA的表达情况;并通过Western Blot实验,检测不同条件下成釉细胞ClC-5、ClC-7、CFTR以及p-Smad2蛋白的表达情况。结果1在高氟环境下,分泌期和成熟期成釉细胞内的红色荧光强度高于对照组。此外,通过RT-qPCR实验,检测到高氟环境下,分泌期和成熟期成釉细胞TGF-β1的mRNA表达降低;通过Western Blot实验,检测到高氟环境下,分泌期和成熟期成釉细胞TGF-β1的蛋白表达降低。2通过RT-qPCR实验,检测到高氟环境下,分泌期成釉细胞ClC-5及ClC-7的mRNA表达升高;通过Western Blot实验,检测到高氟环境下,分泌期成釉细胞ClC-5及ClC-7的蛋白表达升高。与此同时,通过RT-qPCR实验,检测到高氟环境下,成熟期成釉细胞ClC-5、ClC-7及CFTR的mRNA表达升高;通过Western Blot实验,检测到高氟环境下,成熟期成釉细胞ClC-5、ClC-7及CFTR的蛋白表达升高。3以分泌期成釉细胞为研究对象,通过RT-qPCR实验,检测到:与对照组相比,高氟组中ClC-5及ClC-7的mRNA表达升高;与对照组相比,TGF-β1组中C1C-5及ClC-7的mRNA表达降低;与高氟组相比,氟+TGF-β1组中ClC-5及 ClC-7 的 mRNA 表达降低;与 TGF-β1 组相比,TGF-β1+LY2157299 组中 ClC-5及ClC-7的mRNA表达升高。与此同时,通过Western Blot实验,检测到:与对照组相比,高氟组中ClC-5及ClC-7的蛋白表达升高,p-Smad2的蛋白表达降低;与对照组相比,TGF-β1组中ClC-5及ClC-7的蛋白表达降低,p-Smad2的蛋白表达升高;与高氟组相比,氟+TGF-β1组中ClC-5及ClC-7的蛋白表达降低,p-Smad2的蛋白表达升高;与TGF-β1组相比,TGF-β1+LY2157299组中ClC-5及ClC-7的蛋白表达升高,p-Smad2的蛋白表达降低。以成熟期成釉细胞为研究对象,通过RT-qPCR实验,检测到:与对照组相比,高氟组中ClC-5、ClC-7及CFTR的mRNA表达升高;与对照组相比,TGF-β1组中ClC-5、ClC-7及CFTR的mRNA表达降低;与高氟组相比,氟+TGF-β1组中ClC-5、ClC-7及CFTR的mRNA表达降低;与TGF-β1 组相比,TGF-β1+LY2157299 组中 ClC-5、ClC-7 及 CFTR 的 mRNA 表达升高。与此同时,通过Western Blot实验,检测到:与对照组相比,高氟组中ClC-5、ClC-7及CFTR的蛋白表达升高,p-Smad2的蛋白表达降低;与对照组相比,TGF-β1组中ClC-5、ClC-7及CFTR的蛋白表达降低,p-Smad2的蛋白表达升高;与高氟组相比,氟+TGF-β1组中ClC-5、ClC-7及CFTR的蛋白表达降低,p-Smad2的蛋白表达升高;与 TGF-β1 组相比,TGF-β1+LY2157299 组中 ClC-5、ClC-7 及 CFTR 的蛋白表达升高,p-Smad2的蛋白表达降低。结论1在高氟环境下,分泌期和成熟期成釉细胞内发生氟离子积聚。2高氟能够抑制分泌期和成熟期成釉细胞TGF-β1的表达。3高氟能够增强分泌期和成熟期成釉细胞氯离子通道蛋白ClC-5、ClC-7以及CFTR的表达。4首次论证高氟可以通过TGF-β1信号通路调节分泌期和成熟期成釉细胞氯离子通道蛋白ClC-5、ClC-7以及CFTR的表达。