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肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)早期无症状，发病隐匿，约80％的HCC患者确诊时已处于晚期，并且在治疗后易发生复发或转移，患者五年生存率低于20％。如何实现HCC早期筛查、复发转移情况监测对于提高患者生存期及良好预后具有重要意义。循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell，CTC)检测能够对HCC的早期筛查、预后判断、指导个体化治疗提供重要指导作用。CTC在肿瘤早期即会进入血液循环系统，在外周血中检测到CTC即提示肿瘤发生的可能;通过检测CTC能够及时追踪肿瘤动态变化和异质性，察觉肿瘤早期生长，评价药物治疗效果并及时发现复发转移等情况。然而CTC在血液中含量极低，因此开发能够高效捕获肝癌CTC的方法至关重要。
发展高效、强有力的富集和检测CTC的技术是肝癌CTC检测的研究热点。目前，多种CTC捕获检测技术被开发用于提高肝癌CTC捕获能力，如免疫磁分离和微流控技术等。CTC表面标志物是实现肝癌CTC捕获分离的关键。上皮细胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)作为常规的肿瘤标记物，已被广泛用于CTC捕获，如FDA唯一批准用于CTC捕获的CellSearch(R)系统即是利用EpCAM抗体。然而，EpCAM在HCC细胞中的低表达使得该方法不适用于肝癌CTC检测。虽然众多新的细胞表面标志物被研究用于CTC捕获，如去唾液酸糖蛋白受体(Asialoglycoprotein receptor，ASGPR)，甘草酸受体(Glycyrrhizic acid receptor，GLR)、氨基甲酰磷酸合成酶1(Carbamoyl phosphate synthetase ICPS1)、细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、透明质酸(Hyaluronicacid，HA)受体等，但CTC捕获效率仍有待提高。因此，迫切需要选择在HCC中特异高表达、且表达稳定性好的细胞表面受体，提高CTC捕获效率。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3，GPC3)作为HCC的特异性标志物，在HCC早期即过表达，且在正常肝细胞中不表达。课题组前期工作结果显示，GPC3靶向策略有利于肝癌早期诊断，并实施诊断治疗。因此GPC3是合适靶点，可以选择GPC3抗体制备用于肝癌CTC捕获的免疫磁分离系统。免疫磁分离是在磁性纳米粒表面连接抗体，获得抗体标记的磁性纳米载体，与血液样本孵育，通过抗体与CTC表面的特异性标志物结合捕获样本中痕量CTC，具有操作简便、吸附表面积大、磁富集功能好、生物相容性好等优点。由于磁性纳米粒表面缺少活性基团，因此需要在其表面先进行修饰以利于抗体的连接;介孔二氧化硅富含羟基官能团和有序的介孔结构，方便靶向分子化学键合和荧光素装载，实现CTC特异性分离与实时观察。
本论文制备了一种GPC3靶向荧光免疫磁性纳米载体(C6/MMSN-GPC3)，用于HCCCTC高效捕获与实时观察。选用HCCCTC中特异表达、稳定性好的高表达受体GPC3作为靶点捕获HCCCTC，以超顺磁性Fe3O4纳米粒为核心，表面进行二氧化硅材料修饰，其丰富的官能团利于抗体连接，独特的介孔结构能够装载荧光素香豆素6(Coumarin 6，C6)，更方便利用荧光实时观察捕获到的CTC。
论文主要内容如下:
1.C6含量测定方法建立
以紫外分光光度法建立C6含量测定方法，结果表明C6在1-10μg/mL浓度范围内线性良好(R2=0.9999)。日内、日间精密度良好，RSD值小于2％，方法回收率符合测定要求。
2.GPC3抗体修饰荧光免疫磁性纳米载体C6/MMSN-GPC3的制备与表征
以溶胶凝胶法制备磁性介孔二氧化硅纳米粒，然后通过溶剂挥发法载入C6，将GPC3抗体通过化学键连接到介孔磁性二氧化硅纳米粒表面，制备新型荧光免疫磁性纳米载体(C6/MMSN-GPC3)。通过透射电镜法、饱和磁化强度、红外光谱、电位法、元素分析法、共聚焦激光扫描法对载体进行表征。结果表明C6/MMSN-GPC3载体构建成功，C6/MMSN-GPC3粒径为(113.1±7.7)nm，电位值为(-26.43±0.25)mV，饱和磁化强度为11.73emug-1。
3.GPC3抗体修饰荧光免疫磁性纳米载体C6/MMSN-GPC3用于肝癌循环肿瘤细胞捕获与检测的研究
通过对捕获时间、捕获浓度条件优化，筛选出最佳捕获条件。以HepG2细胞作为肝癌CTC模型，Jurkat细胞作为阴性对照，考察C6/MMSN-GPC3的捕获性能，结果显示C6/MMSN-GPC3能够特异性识别HepG2细胞，而与Jurkat细胞没有特异性结合能力;细胞摄取实验显示C6/MMSN-GPC3对HepG2细胞具有特异性靶向能力;在模拟临床样本与肝癌患者外周血中，与基于EpCAM商业化磁珠(MACS(R)Beads)捕获性能比较实验显示，C6/MMSN-GPC3对肝癌CTC显示出更高的捕获效率;通过体外迁移、增殖、细胞毒性实验显示，C6/MMSN-GPC3具有良好的安全性，不需解离细胞与磁性纳米载体，细胞仍能保持活性，可以继续培养，有利于后续下游分析。C6/MMSN-GPC3应用于肝癌临床样本实验结果表明，C6/MMSN-GPC3能成功在临床样本中高效捕获与实时监测到CTC，在健康人的外周血中没有发现CTC，具有良好的临床应用转化前景;在一例Ⅰ期肝癌患者和一例术后患者的外周血中检测到CTC，显示出一定的早期诊断与预后评估的潜能。
综上，本研究基于免疫磁分离技术构建了GPC3靶向免疫磁性荧光纳米载体，同时装载C6，实现肝癌CTC的特异性捕获与实时观察，成功从肝癌患者的外周血中分离得到CTC，具有良好的临床转化潜质。
发展高效、强有力的富集和检测CTC的技术是肝癌CTC检测的研究热点。目前，多种CTC捕获检测技术被开发用于提高肝癌CTC捕获能力，如免疫磁分离和微流控技术等。CTC表面标志物是实现肝癌CTC捕获分离的关键。上皮细胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)作为常规的肿瘤标记物，已被广泛用于CTC捕获，如FDA唯一批准用于CTC捕获的CellSearch(R)系统即是利用EpCAM抗体。然而，EpCAM在HCC细胞中的低表达使得该方法不适用于肝癌CTC检测。虽然众多新的细胞表面标志物被研究用于CTC捕获，如去唾液酸糖蛋白受体(Asialoglycoprotein receptor，ASGPR)，甘草酸受体(Glycyrrhizic acid receptor，GLR)、氨基甲酰磷酸合成酶1(Carbamoyl phosphate synthetase ICPS1)、细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、透明质酸(Hyaluronicacid，HA)受体等，但CTC捕获效率仍有待提高。因此，迫切需要选择在HCC中特异高表达、且表达稳定性好的细胞表面受体，提高CTC捕获效率。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3，GPC3)作为HCC的特异性标志物，在HCC早期即过表达，且在正常肝细胞中不表达。课题组前期工作结果显示，GPC3靶向策略有利于肝癌早期诊断，并实施诊断治疗。因此GPC3是合适靶点，可以选择GPC3抗体制备用于肝癌CTC捕获的免疫磁分离系统。免疫磁分离是在磁性纳米粒表面连接抗体，获得抗体标记的磁性纳米载体，与血液样本孵育，通过抗体与CTC表面的特异性标志物结合捕获样本中痕量CTC，具有操作简便、吸附表面积大、磁富集功能好、生物相容性好等优点。由于磁性纳米粒表面缺少活性基团，因此需要在其表面先进行修饰以利于抗体的连接;介孔二氧化硅富含羟基官能团和有序的介孔结构，方便靶向分子化学键合和荧光素装载，实现CTC特异性分离与实时观察。
本论文制备了一种GPC3靶向荧光免疫磁性纳米载体(C6/MMSN-GPC3)，用于HCCCTC高效捕获与实时观察。选用HCCCTC中特异表达、稳定性好的高表达受体GPC3作为靶点捕获HCCCTC，以超顺磁性Fe3O4纳米粒为核心，表面进行二氧化硅材料修饰，其丰富的官能团利于抗体连接，独特的介孔结构能够装载荧光素香豆素6(Coumarin 6，C6)，更方便利用荧光实时观察捕获到的CTC。
论文主要内容如下:
1.C6含量测定方法建立
以紫外分光光度法建立C6含量测定方法，结果表明C6在1-10μg/mL浓度范围内线性良好(R2=0.9999)。日内、日间精密度良好，RSD值小于2％，方法回收率符合测定要求。
2.GPC3抗体修饰荧光免疫磁性纳米载体C6/MMSN-GPC3的制备与表征
以溶胶凝胶法制备磁性介孔二氧化硅纳米粒，然后通过溶剂挥发法载入C6，将GPC3抗体通过化学键连接到介孔磁性二氧化硅纳米粒表面，制备新型荧光免疫磁性纳米载体(C6/MMSN-GPC3)。通过透射电镜法、饱和磁化强度、红外光谱、电位法、元素分析法、共聚焦激光扫描法对载体进行表征。结果表明C6/MMSN-GPC3载体构建成功，C6/MMSN-GPC3粒径为(113.1±7.7)nm，电位值为(-26.43±0.25)mV，饱和磁化强度为11.73emug-1。
3.GPC3抗体修饰荧光免疫磁性纳米载体C6/MMSN-GPC3用于肝癌循环肿瘤细胞捕获与检测的研究
通过对捕获时间、捕获浓度条件优化，筛选出最佳捕获条件。以HepG2细胞作为肝癌CTC模型，Jurkat细胞作为阴性对照，考察C6/MMSN-GPC3的捕获性能，结果显示C6/MMSN-GPC3能够特异性识别HepG2细胞，而与Jurkat细胞没有特异性结合能力;细胞摄取实验显示C6/MMSN-GPC3对HepG2细胞具有特异性靶向能力;在模拟临床样本与肝癌患者外周血中，与基于EpCAM商业化磁珠(MACS(R)Beads)捕获性能比较实验显示，C6/MMSN-GPC3对肝癌CTC显示出更高的捕获效率;通过体外迁移、增殖、细胞毒性实验显示，C6/MMSN-GPC3具有良好的安全性，不需解离细胞与磁性纳米载体，细胞仍能保持活性，可以继续培养，有利于后续下游分析。C6/MMSN-GPC3应用于肝癌临床样本实验结果表明，C6/MMSN-GPC3能成功在临床样本中高效捕获与实时监测到CTC，在健康人的外周血中没有发现CTC，具有良好的临床应用转化前景;在一例Ⅰ期肝癌患者和一例术后患者的外周血中检测到CTC，显示出一定的早期诊断与预后评估的潜能。
综上，本研究基于免疫磁分离技术构建了GPC3靶向免疫磁性荧光纳米载体，同时装载C6，实现肝癌CTC的特异性捕获与实时观察，成功从肝癌患者的外周血中分离得到CTC，具有良好的临床转化潜质。