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近年来，免疫疗法凭借效果强而持久、特异性高等优势成为一种新兴的癌症治疗手段，此疗法主要是通过激活或重新激活机体的先天性免疫和特异性免疫系统来识别杀伤肿瘤细胞。然而，在临床应用时，免疫疗法仍存在免疫响应率低和免疫相关的全身不良反应等问题。
癌症免疫循环(CIC)的启动是抗肿瘤免疫反应有效识别、杀伤肿瘤细胞的前提，其中肿瘤相关抗原(TAAs)的释放是整个循环中的起始步骤，同时也是一个极其关键的步骤，可通过给予免疫原性细胞死亡(ICD)诱导剂来实现，因此近年来关于ICD诱导剂的研究进行得如火如荼。研究发现，盐酸多柔比星(DOX)除了能对肿瘤细胞产生直接的细胞毒性之外，还具有引起肿瘤细胞ICD的作用，经DOX治疗后，处于垂死状态的肿瘤细胞释放出损伤相关分子模式(DAMPs)和TAAs，进而启动CIC，激活特异性的T细胞抗肿瘤免疫应答。目前DOX作为一种经典的、强效的ICD诱导剂被广泛应用于癌症免疫治疗的研究，但其所附带的不良反应限制了它作为ICD诱导剂在临床上的应用。瘤内给药途径为降低DOX的毒副作用提供了可能，瘤内给药是比静脉给药更高效的局部药物输送方式，能够实现药物在肿瘤部位高浓度蓄积、长时间滞留，最大程度上提高药物的抗肿瘤效果，同时最小化全身副作用。
免疫疗法在实际应用时受到响应率低的限制，因此如何提高免疫响应率成为了研究热点。肿瘤微环境(TMEs)中免疫细胞和肿瘤细胞的代谢发生明显改变，致使免疫抑制性肿瘤微环境(ITMEs)形成，靶向ITMEs中代谢途径成为解除免疫抑制的有效策略，可显著提高免疫响应性。其中，精氨酸代谢在T细胞激活和增殖以及免疫调节过程中扮演着非常重要的角色。精氨酸酶1(ARG1)作为一种免疫抑制酶，能够催化氨基酸L-精氨酸(L-arginine)水解生成L-鸟氨酸(L-omithine)和尿素(urea)。L-精氨酸被降解导致TMEs中L-精氨酸含量大大降低，影响T细胞受体相关CD3ζ链的表达，进而影响T细胞的活化和增殖。因此，在TMEs中直接或间接补充L-精氨酸将成为重新激活T细胞介导的免疫反应的有效方式。而抑制ARG1的活性，减少L-精氨酸的降解，成为间接补充L-精氨酸的极具吸引力的策略。L-正缬氨酸是一种ARG1抑制剂，其价格低廉，副作用小，水溶性佳，但由于L-正缬氨酸具有较高的半抑制浓度(IC50)，在ARG1通路阻断中的应用仍不能令人满意。IC50值较高意味着在使用该抑制剂时，需要设计具有高载药量的药物递送体系。然而到目前为止，设计有效阻断ARG1通路的L-正缬氨酸体系仍是一个巨大的挑战。
智能可注射水凝胶(Smart injectable hydrogels)作为一种富有发展潜力的生物医学材料越来越多的被应用于肿瘤治疗领域，此种凝胶通常以溶液的形式注射，然后在内部（例如酶、pH）或者外部环境（例如光、温度）的刺激下，在注射部位由溶胶态快速转化为凝胶态。智能可注射水凝胶已被用于多种小分子免疫治疗药物的递送研究，不仅能够实现所负载药物的持续、可控释放，还能减少给药次数、减轻药物的免疫副作用。遗憾的是，大多数此类水凝胶只是作为药物储库，治疗药物则被填充在水凝胶微观结构的水腔中，凝胶本身没有抗肿瘤功能和免疫刺激能力。惰性凝胶剂还可能具有潜在的毒副作用，降低治疗药物的载药量。此外，水溶性药物与惰性凝胶剂之间通常没有很强的相互作用，因此很容易从水凝胶储库中释放。综上，设计开发治疗性智能可注射凝胶具有重大意义。例如，由小分子药物构建的水凝胶可以保持高载药量，同时整个体系中不涉及惰性材料，有效避免其潜在毒副作用。最重要的是，由于治疗药物不在水凝胶的基质中，而是直接构成水凝胶的骨架，因此可以实现缓释行为。
基于上述背景，本课题设计了一个理想的温敏水凝胶系统，以ARG1抑制剂作为水凝胶骨架，可同时满足作为温度响应性药物储库和具有免疫刺激的特性，然后引入DOX作为诱发ICD的模型药物，提高抗肿瘤免疫应答的效率，降低全身副作用。L-正缬氨酸的免疫调节凝胶剂用于阻断ARG1通路，从而缓解ITEMs。将DOX作为模型药物引入由L-正缬氨酸共聚物形成的水凝胶(PLN-PEG)中用来触发ICD，与此同时L-正缬氨酸被缓慢释放出来，实现了对ITEMs的持续调节。本课题的主要研究内容、实验方法及结论总结如下:设计并成功构建了负载ICD诱导剂DOX的免疫调节凝胶递送系统(PLN-PEG@DOX)并对其进行了一系列表征。首先制备L-正缬氨酸环内酸酐(NCA)，然后按照一定比例投入甲氧基聚乙二醇胺(Mn=2000)引发L-正缬氨酸NCA的开环聚合(Ring-opening polymerization)，最终得到PLN-PEG分子。1H-NMR谱图表明PLN-PEG的成功合成，其中L-正缬氨酸的聚合度为16.0;利用傅里叶红外光谱(FTIR)和圆二色谱(CD)分别测定PLN-PEG在固态和溶液态时形成的二级结构，实验结果证明无论是处于固态还是溶液态，PLN-PEG主要形成的二级结构都是β折叠。低浓度时，PLN-PEG在水中聚集并自组装形成胶束，利用DLS和TEM测定其水合粒径和形态，结果显示所形成的胶束粒径在120nm左右;高浓度时，PLN-PEG在水中均匀分散，形成可注射水凝胶前体溶液，升高温度可使其由溶胶转变为凝胶状态。采用小瓶倒转法测定PLN-PEG的相变温度，确定后续实验要采用的聚合物浓度。分别通过SEM和TEM观察凝胶态和胶束态的聚合物PLN-PEG与蛋白酶K共孵育不同时间后的形态变化，实验结果证明PLN-PEG具有良好的酶响应性，能够实现L-正缬氨酸在TMEs处的响应性释放。
随后，将经典的ICD诱导剂DOX引入PLN-PEG凝胶载体中，同样利用小瓶倒转法测定溶胶-凝胶相变温度，确定最终制剂的配比(6.0wt％PLN-PEG，0.8mg·mL-1DOX)。采用SEM观察PLN-PEG@DOX水凝胶的微观形态，结果显示制剂呈现具有连续孔洞的网络状结构。制剂的体外释放实验则证明了在pH6.8和蛋白酶K同时存在的情况下药物释放效果更佳。体内降解和瘤内滞留实验分别证明PLN-PEG@DOX凝胶具有优异的生物可降解性和延长药物释放的能力。
选用小鼠黑色素瘤细胞(B16F10)作为肿瘤细胞模型评价PLN-PEG@DOX水凝胶的体外抗肿瘤活性及其免疫效应:MTT实验结果表明，PLN-PEG@DOX水凝胶具有和游离DOX相似的细胞毒性，且细胞毒性具有DOX浓度依赖性，而PLN-PEG水凝胶对细胞几乎没有毒性，生物相容性高;细胞凋亡实验表明该制剂具有明显的促进细胞凋亡和坏死的效应;ARG1抑制实验证明，PLN-PEG水凝胶和PLN-PEG@DOX水凝胶都具有明显的ARG1抑制效果，PLN-PEG凝胶载体在对TMEs产生免疫调节作用的同时降低了免疫治疗的全身毒性，为免疫小分子调节剂的临床应用提供了一种可行的策略;CRT和HMGB1的免疫荧光图片表明PLN-PEG@DOX水凝胶促进DAMPs的大量释放，有效诱导B16F10肿瘤细胞的ICD反应。以上结果表明PLN-PEG@DOX水凝胶具有显著的体外抗肿瘤活性并能激活CIC。
采用荷黑色素瘤（B16F10细胞）的C57BL/6雌鼠对PLN-PEG@DOX水凝胶的体内抗肿瘤效果进行评价，同时进一步研究其抗肿瘤机制。构建小鼠双边荷瘤模型，抑瘤实验结果表明化疗与免疫联合治疗显著优于单独的化疗或免疫治疗。另外，无论是对于原位肿瘤还是远位肿瘤，该制剂均展现出了优异的抑制效果;取小鼠腹股沟淋巴结和肿瘤组织进行流式(FCM)检测，结果显示PLN-PEG@DOX水凝胶组淋巴结内mDCs的比例明显提高，原位和远位瘤中的肿瘤浸润CD8+和CD4+T细胞数量远高于NS组，并且Tregs数量明显低于NS组。随后检测了小鼠脾脏中T淋巴细胞的比例和血清中细胞因子的含量，结果显示PLN-PEG@DOX水凝胶有效激活机体系统性的免疫应答。上述结果显示，该制剂在小鼠体内具有优异的抑瘤效果并且能够引发较强的系统性免疫效应。此外，主要脏器的组织学分析结果和小鼠体重变化曲线显示制剂没有明显毒性。构建小鼠肺转移模型，其实验结果表明PLN-PEG@DOX水凝胶具有强大的抑制肿瘤细胞向肺组织转移的效果。
癌症免疫循环(CIC)的启动是抗肿瘤免疫反应有效识别、杀伤肿瘤细胞的前提，其中肿瘤相关抗原(TAAs)的释放是整个循环中的起始步骤，同时也是一个极其关键的步骤，可通过给予免疫原性细胞死亡(ICD)诱导剂来实现，因此近年来关于ICD诱导剂的研究进行得如火如荼。研究发现，盐酸多柔比星(DOX)除了能对肿瘤细胞产生直接的细胞毒性之外，还具有引起肿瘤细胞ICD的作用，经DOX治疗后，处于垂死状态的肿瘤细胞释放出损伤相关分子模式(DAMPs)和TAAs，进而启动CIC，激活特异性的T细胞抗肿瘤免疫应答。目前DOX作为一种经典的、强效的ICD诱导剂被广泛应用于癌症免疫治疗的研究，但其所附带的不良反应限制了它作为ICD诱导剂在临床上的应用。瘤内给药途径为降低DOX的毒副作用提供了可能，瘤内给药是比静脉给药更高效的局部药物输送方式，能够实现药物在肿瘤部位高浓度蓄积、长时间滞留，最大程度上提高药物的抗肿瘤效果，同时最小化全身副作用。
免疫疗法在实际应用时受到响应率低的限制，因此如何提高免疫响应率成为了研究热点。肿瘤微环境(TMEs)中免疫细胞和肿瘤细胞的代谢发生明显改变，致使免疫抑制性肿瘤微环境(ITMEs)形成，靶向ITMEs中代谢途径成为解除免疫抑制的有效策略，可显著提高免疫响应性。其中，精氨酸代谢在T细胞激活和增殖以及免疫调节过程中扮演着非常重要的角色。精氨酸酶1(ARG1)作为一种免疫抑制酶，能够催化氨基酸L-精氨酸(L-arginine)水解生成L-鸟氨酸(L-omithine)和尿素(urea)。L-精氨酸被降解导致TMEs中L-精氨酸含量大大降低，影响T细胞受体相关CD3ζ链的表达，进而影响T细胞的活化和增殖。因此，在TMEs中直接或间接补充L-精氨酸将成为重新激活T细胞介导的免疫反应的有效方式。而抑制ARG1的活性，减少L-精氨酸的降解，成为间接补充L-精氨酸的极具吸引力的策略。L-正缬氨酸是一种ARG1抑制剂，其价格低廉，副作用小，水溶性佳，但由于L-正缬氨酸具有较高的半抑制浓度(IC50)，在ARG1通路阻断中的应用仍不能令人满意。IC50值较高意味着在使用该抑制剂时，需要设计具有高载药量的药物递送体系。然而到目前为止，设计有效阻断ARG1通路的L-正缬氨酸体系仍是一个巨大的挑战。
智能可注射水凝胶(Smart injectable hydrogels)作为一种富有发展潜力的生物医学材料越来越多的被应用于肿瘤治疗领域，此种凝胶通常以溶液的形式注射，然后在内部（例如酶、pH）或者外部环境（例如光、温度）的刺激下，在注射部位由溶胶态快速转化为凝胶态。智能可注射水凝胶已被用于多种小分子免疫治疗药物的递送研究，不仅能够实现所负载药物的持续、可控释放，还能减少给药次数、减轻药物的免疫副作用。遗憾的是，大多数此类水凝胶只是作为药物储库，治疗药物则被填充在水凝胶微观结构的水腔中，凝胶本身没有抗肿瘤功能和免疫刺激能力。惰性凝胶剂还可能具有潜在的毒副作用，降低治疗药物的载药量。此外，水溶性药物与惰性凝胶剂之间通常没有很强的相互作用，因此很容易从水凝胶储库中释放。综上，设计开发治疗性智能可注射凝胶具有重大意义。例如，由小分子药物构建的水凝胶可以保持高载药量，同时整个体系中不涉及惰性材料，有效避免其潜在毒副作用。最重要的是，由于治疗药物不在水凝胶的基质中，而是直接构成水凝胶的骨架，因此可以实现缓释行为。
基于上述背景，本课题设计了一个理想的温敏水凝胶系统，以ARG1抑制剂作为水凝胶骨架，可同时满足作为温度响应性药物储库和具有免疫刺激的特性，然后引入DOX作为诱发ICD的模型药物，提高抗肿瘤免疫应答的效率，降低全身副作用。L-正缬氨酸的免疫调节凝胶剂用于阻断ARG1通路，从而缓解ITEMs。将DOX作为模型药物引入由L-正缬氨酸共聚物形成的水凝胶(PLN-PEG)中用来触发ICD，与此同时L-正缬氨酸被缓慢释放出来，实现了对ITEMs的持续调节。本课题的主要研究内容、实验方法及结论总结如下:设计并成功构建了负载ICD诱导剂DOX的免疫调节凝胶递送系统(PLN-PEG@DOX)并对其进行了一系列表征。首先制备L-正缬氨酸环内酸酐(NCA)，然后按照一定比例投入甲氧基聚乙二醇胺(Mn=2000)引发L-正缬氨酸NCA的开环聚合(Ring-opening polymerization)，最终得到PLN-PEG分子。1H-NMR谱图表明PLN-PEG的成功合成，其中L-正缬氨酸的聚合度为16.0;利用傅里叶红外光谱(FTIR)和圆二色谱(CD)分别测定PLN-PEG在固态和溶液态时形成的二级结构，实验结果证明无论是处于固态还是溶液态，PLN-PEG主要形成的二级结构都是β折叠。低浓度时，PLN-PEG在水中聚集并自组装形成胶束，利用DLS和TEM测定其水合粒径和形态，结果显示所形成的胶束粒径在120nm左右;高浓度时，PLN-PEG在水中均匀分散，形成可注射水凝胶前体溶液，升高温度可使其由溶胶转变为凝胶状态。采用小瓶倒转法测定PLN-PEG的相变温度，确定后续实验要采用的聚合物浓度。分别通过SEM和TEM观察凝胶态和胶束态的聚合物PLN-PEG与蛋白酶K共孵育不同时间后的形态变化，实验结果证明PLN-PEG具有良好的酶响应性，能够实现L-正缬氨酸在TMEs处的响应性释放。
随后，将经典的ICD诱导剂DOX引入PLN-PEG凝胶载体中，同样利用小瓶倒转法测定溶胶-凝胶相变温度，确定最终制剂的配比(6.0wt％PLN-PEG，0.8mg·mL-1DOX)。采用SEM观察PLN-PEG@DOX水凝胶的微观形态，结果显示制剂呈现具有连续孔洞的网络状结构。制剂的体外释放实验则证明了在pH6.8和蛋白酶K同时存在的情况下药物释放效果更佳。体内降解和瘤内滞留实验分别证明PLN-PEG@DOX凝胶具有优异的生物可降解性和延长药物释放的能力。
选用小鼠黑色素瘤细胞(B16F10)作为肿瘤细胞模型评价PLN-PEG@DOX水凝胶的体外抗肿瘤活性及其免疫效应:MTT实验结果表明，PLN-PEG@DOX水凝胶具有和游离DOX相似的细胞毒性，且细胞毒性具有DOX浓度依赖性，而PLN-PEG水凝胶对细胞几乎没有毒性，生物相容性高;细胞凋亡实验表明该制剂具有明显的促进细胞凋亡和坏死的效应;ARG1抑制实验证明，PLN-PEG水凝胶和PLN-PEG@DOX水凝胶都具有明显的ARG1抑制效果，PLN-PEG凝胶载体在对TMEs产生免疫调节作用的同时降低了免疫治疗的全身毒性，为免疫小分子调节剂的临床应用提供了一种可行的策略;CRT和HMGB1的免疫荧光图片表明PLN-PEG@DOX水凝胶促进DAMPs的大量释放，有效诱导B16F10肿瘤细胞的ICD反应。以上结果表明PLN-PEG@DOX水凝胶具有显著的体外抗肿瘤活性并能激活CIC。
采用荷黑色素瘤（B16F10细胞）的C57BL/6雌鼠对PLN-PEG@DOX水凝胶的体内抗肿瘤效果进行评价，同时进一步研究其抗肿瘤机制。构建小鼠双边荷瘤模型，抑瘤实验结果表明化疗与免疫联合治疗显著优于单独的化疗或免疫治疗。另外，无论是对于原位肿瘤还是远位肿瘤，该制剂均展现出了优异的抑制效果;取小鼠腹股沟淋巴结和肿瘤组织进行流式(FCM)检测，结果显示PLN-PEG@DOX水凝胶组淋巴结内mDCs的比例明显提高，原位和远位瘤中的肿瘤浸润CD8+和CD4+T细胞数量远高于NS组，并且Tregs数量明显低于NS组。随后检测了小鼠脾脏中T淋巴细胞的比例和血清中细胞因子的含量，结果显示PLN-PEG@DOX水凝胶有效激活机体系统性的免疫应答。上述结果显示，该制剂在小鼠体内具有优异的抑瘤效果并且能够引发较强的系统性免疫效应。此外，主要脏器的组织学分析结果和小鼠体重变化曲线显示制剂没有明显毒性。构建小鼠肺转移模型，其实验结果表明PLN-PEG@DOX水凝胶具有强大的抑制肿瘤细胞向肺组织转移的效果。