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骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)作为局部诱导成骨因子，由于其强大的骨诱导活力，在医学研究和临床上受到广泛关注。大肠杆菌表达系统因其产量高、操作简单被用于重组人骨形态发生蛋白(rhBMP-2)的生产，课题组前期已获得重组质粒，并经测序验证后导入E.coliBL21感受态细胞，得到含rhBMP-2基因工程菌株。但原核生物没有翻译后的加工处理过程，rhBMP-2大多以包涵体的状态存在，需要重新折叠成正确结构，才能得到有活性的rhBMP-2，但这复性的过程往往收率较低。因此，rhBMP-2包涵体的复性和纯化成为目前研究中的难点，建立一种高效的生产制备工艺是获得具有较高生物活性rhBMP-2的关键。
尽管BMP-2具有显著的骨诱导能力，但其半衰期短，在体内很快会被酶降解。为了保持BMP-2的体内生物活性，可将其与适当的载体材料结合后再植入体内，通过载体材料的特性在体内缓慢释放，使其在治疗部位保持长期的刺激作用，从而实现有效骨愈合。BMP-2与载体材料结合，除考虑活性的影响外，还应充分考虑临床的适应性。可注射水凝胶相较于传统固体植入材料，其创口小、术后感染风险小，可针对不同形状的缺损进行充分填充，成为目前骨修复材料的研究热点。
本课题首先将rhBMP-2工程菌株发酵，摸索出rhBMP-2包涵体复性纯化的条件，获得了高纯度、高生物活性的rhBMP-2。之后我们又制备出负载rhBMP-2的可注射聚谷氨酸水凝胶材料，并对其安全性及体内成骨活性进行评价，为其作为支架材料用于治疗骨损伤、诱导骨愈合提供理论支持。本论文围绕以上内容所展开，主要研究结果包括以下几个方面:
1.rhBMP-2的表达纯化及活性检测
将构建的rhBMP-2工程菌株进行高密度发酵，超声破碎后收集包涵体，其湿重可达20g/L。将其裂解后进行复性，蛋白复性率大于40％。采用肝素亲和层析柱对其纯化后，二聚体蛋白纯度达95.6％。之后采用Westernblot和HPLC方法，将纯化后的rhBMP-2定性分析，验证结果显示与标准蛋白一致。并且体外活性结果表明，纯化后的rhBMP-2能显著促进C2C12细胞中ALP及成骨相关特异性转录因子RUNX-2、OCN的表达(P＜0.05)，具有较强的骨诱导活力。
2.γ-PGA可注射水凝胶的制备及表征
通过化学交联法制备出γ-PGA可注射水凝胶材料，并将rhBMP-2负载于水凝胶材料上。利用SEM观察负载rhBMP-2水凝胶和空白水凝胶材料的内部微结构，发现均呈海绵状多孔结构，孔隙平均直径分别为35μm和10μm，孔间互相连通，有利于细胞的附着以及营养物质及代谢废物的输送。通过半透膜透析法进行体外释放实验，测定不同时间点透析液中rhBMP-2的含量，并绘制释放曲线，发现rhBMP-2在30d内平稳缓慢释放。最后，将不同浓度的γ-PGA水凝胶滤液与L929细胞共培养，利用CCK-8法检测细胞相对增殖度(relative growth rate，RGR)，结果表明各组无显著差异，细胞毒性等级为0-1级，水凝胶材料无细胞毒性。
3.负载rhBMP-2水凝胶的成骨活性评价
建立小鼠肌袋异位成骨模型，将负载rhBMP-2的水凝胶或rhBMP-2溶液，以及市售骨优导产品植入小鼠后腿的肌袋内。术后4周，进行X射线拍照、血液中ALP含量检测、MicroCT及组织学观察。大体观察发现，rhBMP-2溶液组、rhBMP-2水凝胶组均有骨样物质形成，但rhBMP-2水凝胶组的ALP含量、新生骨面积、重量均显著高于rhBMP-2溶液组(P＜0.05)。此外，MicroCT及组织学观察发现，rhBMP-2水凝胶组的骨小梁数量、厚度以及胶原纤维生成量明显优于rhBMP-2溶液组，展现出良好的异位成骨能力。
尽管BMP-2具有显著的骨诱导能力，但其半衰期短，在体内很快会被酶降解。为了保持BMP-2的体内生物活性，可将其与适当的载体材料结合后再植入体内，通过载体材料的特性在体内缓慢释放，使其在治疗部位保持长期的刺激作用，从而实现有效骨愈合。BMP-2与载体材料结合，除考虑活性的影响外，还应充分考虑临床的适应性。可注射水凝胶相较于传统固体植入材料，其创口小、术后感染风险小，可针对不同形状的缺损进行充分填充，成为目前骨修复材料的研究热点。
本课题首先将rhBMP-2工程菌株发酵，摸索出rhBMP-2包涵体复性纯化的条件，获得了高纯度、高生物活性的rhBMP-2。之后我们又制备出负载rhBMP-2的可注射聚谷氨酸水凝胶材料，并对其安全性及体内成骨活性进行评价，为其作为支架材料用于治疗骨损伤、诱导骨愈合提供理论支持。本论文围绕以上内容所展开，主要研究结果包括以下几个方面:
1.rhBMP-2的表达纯化及活性检测
将构建的rhBMP-2工程菌株进行高密度发酵，超声破碎后收集包涵体，其湿重可达20g/L。将其裂解后进行复性，蛋白复性率大于40％。采用肝素亲和层析柱对其纯化后，二聚体蛋白纯度达95.6％。之后采用Westernblot和HPLC方法，将纯化后的rhBMP-2定性分析，验证结果显示与标准蛋白一致。并且体外活性结果表明，纯化后的rhBMP-2能显著促进C2C12细胞中ALP及成骨相关特异性转录因子RUNX-2、OCN的表达(P＜0.05)，具有较强的骨诱导活力。
2.γ-PGA可注射水凝胶的制备及表征
通过化学交联法制备出γ-PGA可注射水凝胶材料，并将rhBMP-2负载于水凝胶材料上。利用SEM观察负载rhBMP-2水凝胶和空白水凝胶材料的内部微结构，发现均呈海绵状多孔结构，孔隙平均直径分别为35μm和10μm，孔间互相连通，有利于细胞的附着以及营养物质及代谢废物的输送。通过半透膜透析法进行体外释放实验，测定不同时间点透析液中rhBMP-2的含量，并绘制释放曲线，发现rhBMP-2在30d内平稳缓慢释放。最后，将不同浓度的γ-PGA水凝胶滤液与L929细胞共培养，利用CCK-8法检测细胞相对增殖度(relative growth rate，RGR)，结果表明各组无显著差异，细胞毒性等级为0-1级，水凝胶材料无细胞毒性。
3.负载rhBMP-2水凝胶的成骨活性评价
建立小鼠肌袋异位成骨模型，将负载rhBMP-2的水凝胶或rhBMP-2溶液，以及市售骨优导产品植入小鼠后腿的肌袋内。术后4周，进行X射线拍照、血液中ALP含量检测、MicroCT及组织学观察。大体观察发现，rhBMP-2溶液组、rhBMP-2水凝胶组均有骨样物质形成，但rhBMP-2水凝胶组的ALP含量、新生骨面积、重量均显著高于rhBMP-2溶液组(P＜0.05)。此外，MicroCT及组织学观察发现，rhBMP-2水凝胶组的骨小梁数量、厚度以及胶原纤维生成量明显优于rhBMP-2溶液组，展现出良好的异位成骨能力。