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白内障是世界范围内的主要致盲原因，目前尚没有有效的药物治疗手段可以完全阻止或者延缓其进展，通过手术摘除白内障是最主要的治疗方法。早期临床资料显示，约有41％的白内障患者术后会出现后发性白内障(after cataract，又称后囊膜混浊，posterior capsular opacification，PCO)。随着手术技术的改进和人工晶状体的改良，PCO的发生率有所下降，但目前仍约有20％～25％的术后患者发生PCO。PCO是现代白内障摘除术后的主要并发症，也是影响术后视力的主要原因，在一定程度上影响了手术治疗的效果[4]。发生PCO和需要行二次激光手术的患者主要是年轻人，尤其是儿童，而且激光手术还具有一定的风险(如视网膜脱离，黄斑囊样水肿等)。因此，明确PCO的发病机理，从而寻求更为安全有效的防治方法是非常重要的。许多因素对后囊混浊的发生有影响，包括复杂的、有创的手术，残留的晶状体上皮细胞(lens epithelial cells，LECs)及皮质，血—房水屏障破坏释放的炎症介质，术中植入的人工晶状体的材料、设计及植入的位置等。目前对PCO发生机制的研究认为，术后残留的LECs增殖、上皮间质转分化(epithelial mesenchymal transition，EMT)以及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)是引起PCO的主要原因[7]。晶状体上皮细胞间质转分化是指晶状体上皮细胞由上皮细胞向间质转分化，出现类肌纤维母细胞样的特征，以上皮细胞极性的丧失及间质特性的获得为主要特征，是前囊膜下白内障(anterior subcapsular cataract，ASC)和PCO的主要病理改变。迄今为止，尚未完全明确刺激晶状体上皮细胞异常增殖、转分化发生以及细胞外基质产生的信号因子，但在离体后发障模型中的研究已证实多种调控因素参与了PCO的发生过程，包括转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)、成纤维生长因子(fibroblast growth factor，FGF)和表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)等。其中，TGF-β在调节细胞增殖、转分化和细胞外基质的产生中起着至关重要的作用。
第一部分
转化生长因子β2对人晶状体上皮细胞增殖及上皮间质转分化的作用
[研究目的]
研究转化生长因子β2(transforming growth factor-β2，TGF-β2)对人晶状体上皮细胞增殖及上皮间质转分化(epithelial mesenchymal transition，EMT)的作用，建立后发性白内障(posterior capsular opacification，PCO)的离体研究模型，为全面明确TGF-β2对晶状体上皮细胞间质转分化的作用机制提供基础。
[研究方法]
体外培养的人晶状体上皮细胞株HLE B-3，用不同浓度的TGF-β2处理后，分别采用MTT法测定其对细胞增殖的影响；应用PI细胞周期染色分析检测细胞周期的改变；应用共聚焦显微镜、RT-PCR法和免疫印迹法观察和分析晶状体上皮细胞中缝隙连接蛋白(connexin43，CX43)、纤维连接蛋白(fibronectin，Fn)、结蛋白(desmin)和整合素β1(integrinβ1)等细胞转分化相关基因和蛋白的变化。
[研究结果]
TGF-β2是晶状体上皮细胞重要的促转分化生长因子。TGF-β2对晶状体上皮细胞增殖起明显的抑制作用，且呈现时间和浓度的依赖性，当浓度为100 pg/ml时，这种抑制作用达到了平台期。TGF-β2刺激后S期的晶状体上皮细胞数量明显降低，而G1期细胞数量明显增加。TGF-β2诱导后的细胞由单层立方形变为长梭形，呈纤维细胞样形态。TGF-β2不仅能够显著地下调晶状体上皮细胞特征基因connexin43的表达，而且能够促使细胞外间质成分fibronectin、desmin和integrinβ1表达的增多。
[研究结论]
TGF-β2能够明显抑制晶状体上皮细胞的增殖，限制了细胞周期的正常进程，使得细胞处于异常增殖的状态。TGF-β2能够诱导晶状体上皮细胞形态发生改变，细胞上皮特征逐渐丧失，获得间质细胞的特性，促使细胞由上皮向间质转分化，成功构建后发性白内障的离体研究模型。
第二部分
PI3K/Akt通路参与转化生长因子β2诱导人晶状体上皮细胞间质转分化过程
[研究目的]
在第一部分实验的基础上我们发现，用TGF-β2处理晶状体上皮细胞后，细胞增殖受到抑制，大部分细胞出现上皮间质转分化，而这种现象与PCO的形成密切相关，明确其调控机制有助于维持晶状体上皮细胞正常的结构与功能。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt通路在增殖、分化、新陈代谢和凋亡等细胞活动过程中起着重要作用。因此，本部分的研究目的是研究MAPK和PI3K/Akt信号通路是否参与TGF-β2诱导的晶状体上皮细胞间质转分化过程及其相关的作用机制，进一步分析和阐明TGF-β2促进PCO形成的机理。
[研究方法]
培养的人晶状体上皮细胞株HLE B-3，用100 pg/ml的TGF-β2处理后，收集处理后的细胞。应用免疫印迹法检测TGF-β2对晶状体上皮细胞内磷酸化和总p38MAPK、ERK1/2及Akt水平的变化。加用PI3K特异性抑制剂LY294002阻断PI3K/Akt信号通路，分别采用共聚焦显微镜和免疫印迹法观察和分析connexin43、fibronectin、desmin和integrinβ1等细胞转分化相关蛋白表达的变化。
[研究结果]
TGF-β2刺激后晶状体上皮细胞ERK1/2和p38 MAPK的磷酸化水平稍有增加，但与对照组相比无统计学差异。TGF-β2可以促使Akt磷酸化水平明显升高(P<0.05)，激活晶状体上皮细胞内的PI3K/Akt通路。加用PI3K特异性抑制剂LY294002干预后，connexin43的表达则较单用TGF-β2组明显升高，两者相比有明显的统计学差异(P<0.05)，desmin蛋白的表达较单用TGF-β2组减少，但两组相比无显著统计学差异。TGF-β2诱导的fibronectin和integrinβ1表达的上调也可被LY294002有效地抑制。
[研究结论]
TGF-β2能够激活PI3K/Akt信号转导通路，从而参与了TGF-β2诱导的晶状体上皮细胞间质转分化过程。阻断PI3K/Akt信号通路可有效地抑制TGF-β2诱导的上皮间质转分化进程，从而抑制TGF-β2参与的后发性白内障的发生。
本课题从研究TGF-β2诱导晶状体上皮细胞间质转分化的作用机制入手，分析和探讨了丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt等与细胞增殖、转分化密切相关信号通路在TGF-β2诱导的人晶状体上皮细胞间质转分化过程的调控作用。研究发现，TGF-β2对晶状体上皮细胞增殖起明显的抑制作用，限制了细胞周期的正常进程，晶状体上皮细胞的特性逐渐丧失，逐渐获得了间质细胞的特点，细胞由上皮向间质转分化，成功地构建后发性白内障的离体研究模型。我们还发现，TGF-β2能够激活PI3K/Akt信号通路，阻断PI3K/Akt信号通路可有效地抑制TGF-β2诱导的上皮间质转分化进程，说明PI3K/Akt及其介导的蛋白激酶通路在TGF-β2引起的晶状体上皮细胞间质转分化过程中具有重要的调控作用。