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背景与目的
肺癌在最近几十年里逐渐成为全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，吸烟是肺癌发生的重要环境危险因素之一。随着对表观遗传研究的深入了解，长链非编码RNA(long non-codingRNA，lncRNA)作为非编码RNA中重要组成部分逐渐被人们所认识。lncRNA主要通过表观遗传学、转录及转录后水平调控基因的表达和翻译，参与对肿瘤生物学调控功能。目前，对于lncRNA作为环境化学致癌物暴露标记以及其参与化学致癌过程的报道研究较少。本研究旨在寻找香烟烟雾暴露人群血清差异表达lncRNA，进一步探寻lncRNA在香烟烟雾致癌过程中作用功能和意义。
第一部分香烟选择及烟草提取物对16HBE恶性转化
环境因素是疾病发生的重要因素之一。据估计，人类疾病70%-90%的危险度可归因于环境暴露的影响。吸烟是肺癌发生的重要环境危险因素。肺癌在最近几十年里逐渐成为全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。因此，对吸烟致肺癌发病机制的探讨有着重要的现实意义。
方法
本研究针对体检工人作为主要对象，对体检工人进行随机进行调查，对香烟选择偏好、吸烟量以及等进行调查。根据调查结果，选择受试香烟。制备香烟提取物，对16HBE细胞急性暴露，再慢性诱导。采用大体形态、软琼脂克隆、平板克隆、划痕和裸鼠成瘤对恶性转化细胞测定。
结果
通过吸烟人群调查，选择国产香烟作为受试香烟。将较高浓度CSE给予16HBE细胞暴露，表现强烈的毒性作用。给予低浓度CSE暴露12h，受试细胞存活率无明显改变，24h后，0.5%、1.0%、2.0%、4.0%浓度CSE细胞增殖能力明显增加(P≤0.01)，48h后，2.0%、4.0%和8.0%浓度细胞存活率明显下降(P≤0.01或P≤0.05)。发现经过恶性转化的细胞具有堆积增长倾向，且平板克隆形成能力增强，可以在软琼脂中形成细胞克隆，以及划痕修复能力和裸鼠成瘤能力增强等恶性细胞的特征。
结论
1从香烟选择喜好确定本次实验受试香烟；
2确认香烟提取物(CSE)的制作方法和质控方案，对16HBE细胞的急性暴露结果初步确定慢性诱导剂量。
3从细胞大体外观、平板克隆、软琼脂克隆、划痕和裸鼠成瘤实验等指标初步确认CSE具有对16HBE恶性转化能力，且建立的CSE-T细胞可作为国产香烟诱导呼吸道上皮细胞恶性转化模型。
第二部分吸烟人群血清中linc00152差异表达及对CSE诱导16HBE细胞EMT改变的影响
目前，研究证明CSE在诱导16HBE过程中发生了EMT的改变，且lncRNA可能在该过程中有一定的调控作用。因此，探讨lncRNA在CSE致16HBE细胞的EMT过程中作用，对于香烟烟雾致呼吸道上皮细胞恶性转化过程认识，以及对临床肺癌患者的肿瘤侵袭和转移等方面的机制探讨具有一定的参考意义。
方法
寻找吸烟暴露人群血清差异表达的lncRNA，再将lncRNA在肺癌细胞和肺癌组织中验证，探寻肺癌组织中lncRNA与肺癌病例特征关联。通过对E-cadherin、N-cadherin和Vimentin三种EMT标志蛋白在CSE诱导16HBE的过程中改变，再结合lncRNA干扰后，观察受试细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin改变。最后对受试细胞的转移能力进行裸鼠转移瘤模型动物验证。
结果
发现血清中linc00152的表达与人群吸烟量有关，提示linc00152可能是人群烟草暴露的标志物。结合linc00152在人群肺癌组织中的表达特征，提示可能在肺癌的转移、肿瘤生长等方面有一定的促进作用。在几种常见肺癌细胞(95D、H460、H1299和A549)以及CSE-T细胞中均呈现linc00152高表达(P≤0.01)；CSE暴露24h后，linc00152的表达随CSE浓度增高呈现表达增高(P≤0.01或P≤0.05)，linc00152在CSE诱导16HBE恶性转化中间代细胞表达依次增高(P≤0.01或P≤0.05)。
不同剂量CSE暴露16HBE，在早期(24h)受试细胞中Ecadherin的mRNA的表达随CSE暴露量的增加即出现下降(P≤0.01或P≤0.05)，不同代次CSE诱导细胞随诱导代次增加逐渐呈现Ecadherin的mRNA表达降低(P≤0.01或P≤0.05)。通过qPCR和WB实验手段，发现CSE-30P和CSE-T细胞中Ecadherin的表达明显降低(P≤0.01或P≤0.05)，同时Ncadherin和Vimentin两者表达有明显增高(P≤0.01或P≤0.05)。再将CSE-T细胞中linc00152干扰后，发现受试细胞中Ecadherin表达增高(P≤0.01)，且Ncadherin和Vimentin表达降低(P≤0.01或P≤0.05)，细胞免疫荧光测定也与该结果相一致。
将受试细胞给予裸鼠尾静脉注射后，从16d开始受试动物体重开始改变，CSE-T和NC组动物有明显的体重降低。24d后处死动物，发现主要出现肺脏转移，其余肝脏和肾脏少量转移。干扰linc00152细胞株可以减少受试细胞体内转移。
结论
1.linc00152在吸烟人群血清中高表达，可以作为香烟暴露人群血清标志物；
2linc00152在肺癌组织样本中较癌旁组织表达明显增高，通过病例样本整理，linc00152高表达与肺癌患者的吸烟习惯、以及肺癌组织大小、转移和分化等相关；
3.16HBE细胞在CSE诱导过程中发生了EMT改变，这种改变可能在CSE暴露早期已经开始；
4linc00152可能在CSE诱导16HBE细胞EMT改变过程中起促进作用，且动物体内实验证实具有促进CSE-T体内转移的能力。
第三部分linc00152对CSE-T细胞周期影响作用机制探讨
细胞的增殖失控是癌症的主要特征之一，细胞周期、凋亡的异常均与细胞的异常增殖有关。我们发现CSE-T细胞周期较对照组细胞有明显的改变，思考CSE-T细胞可能有周期调控失控导致细胞的增殖异常。目前，ceRNA(內源性竞争)作为非编码RNA在生物体内调控作用模式得到了广泛的认同。本次实验从lncRNA通过miRNA的对周期调控蛋白的作用方式，探讨linc00152在CSE-T的周期改变中可能的调控机制。
方法
通过生物信息学分析和预测，寻找linc00152下游的直接互作miRNA，以及miRNA下游的靶基因。再结合荧光素酶报告基因，验证三者之间的作用关系。再用基因干扰和共转染技术观察三者间作用关系。从细胞的周期改变观察linc00152对CSE-T和H1299的周期影响作用。再进一步通过qPCR和WB技术对cyclinD1下游周期调控通路进行验证。利用裸鼠体内实验证linc00152对CSE-T的细胞增殖调控影响作用。
结果
通过在线生物信息学网站，linc00152可能直接结合的miRNA进行预测，得到与linc00152直接作用的miR-193a-3p和miR-193b。对miR-193a-3p和miR-193b下游靶向的目的基因预测，得到两者均与CCND1关系密切程度较高。对CSE-T进行linc00152干扰，共转染和表达量比较后，提示在我们的实验体系中miR-193b在linc00152与miR-193家族的内源性竞争中占主导地位。
在肺癌细胞中linc00152和CCND1的表达之间呈现高度相关(r=0.943，P=0.005)；且在肺癌组织中linc00152和CCND1的表达呈现显著的正相关关系(r=0.712,P≤0.000)。
通过WB验证，在H1299和CSE-T两种细胞中可能存在着由linc00152内源性的竞争结合miR-193b，导致miR-193b表达下降，引起cyclinD1表达增高的现象。对细胞周期和增殖测定验证linc00152对cyclinD1的调控作用。再利用qPCR和WB方法验证了linc00152对cyclinD1下游周期蛋白通路的调控作用，以及利用构建稳转细胞株通过体内成瘤实验证实linc00152具有抑制CSE-T增殖的能力。
结论
1CSE对16HBE细胞的急性和慢性诱导后，均可以造成细胞周期改变；
2linc00152在肺癌细胞和组织中与CCND1的表达呈现显著正相关；
3linc00152可能主要通过与miR-193b(而不是miR-193a-3p)的内源性竞争作用对cyclinD1进行调控；
4linc00152主要通过对cyclinD1的调控，后者再从CDK4/CDK6/Rb/p-Rb
/E2F1途径对细胞周期产生影响，继而对受试细胞增殖和裸鼠成瘤能力造成影响。
全文结论
1.通过对16HBE细胞的香烟提取物CSE长期诱导实验，确定CSE具有使16HBE细胞恶性转化的能力，且建立的CSE-T细胞系可以作为香烟诱导呼吸道上皮细胞恶性转化的细胞模型。
2.linc00152作为吸烟人群血清中差异表达lncRNA，可以作为香烟暴露的接触标志物，且linc00152可能在CSE诱导16HBE恶性转化过程EMT过程有促进作用。
3.我们认为在CSE-T和H1299细胞中linc00152可能主要通过与miR-193b(而不是miR-193a-3p)的ceRNA作用对cyclinD1进行调控。
4.linc00152可能从“linc00152/miR193b/cyclinD1轴”对CSE-T和H1299细胞的周期调控，进而通过“CDK4/CDK6/Rb/p-Rb/E2F1轴”对CSE-T和H1299细胞周期产生影响，从而影响细胞的增殖能力。
肺癌在最近几十年里逐渐成为全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，吸烟是肺癌发生的重要环境危险因素之一。随着对表观遗传研究的深入了解，长链非编码RNA(long non-codingRNA，lncRNA)作为非编码RNA中重要组成部分逐渐被人们所认识。lncRNA主要通过表观遗传学、转录及转录后水平调控基因的表达和翻译，参与对肿瘤生物学调控功能。目前，对于lncRNA作为环境化学致癌物暴露标记以及其参与化学致癌过程的报道研究较少。本研究旨在寻找香烟烟雾暴露人群血清差异表达lncRNA，进一步探寻lncRNA在香烟烟雾致癌过程中作用功能和意义。
第一部分香烟选择及烟草提取物对16HBE恶性转化
环境因素是疾病发生的重要因素之一。据估计，人类疾病70%-90%的危险度可归因于环境暴露的影响。吸烟是肺癌发生的重要环境危险因素。肺癌在最近几十年里逐渐成为全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。因此，对吸烟致肺癌发病机制的探讨有着重要的现实意义。
方法
本研究针对体检工人作为主要对象，对体检工人进行随机进行调查，对香烟选择偏好、吸烟量以及等进行调查。根据调查结果，选择受试香烟。制备香烟提取物，对16HBE细胞急性暴露，再慢性诱导。采用大体形态、软琼脂克隆、平板克隆、划痕和裸鼠成瘤对恶性转化细胞测定。
结果
通过吸烟人群调查，选择国产香烟作为受试香烟。将较高浓度CSE给予16HBE细胞暴露，表现强烈的毒性作用。给予低浓度CSE暴露12h，受试细胞存活率无明显改变，24h后，0.5%、1.0%、2.0%、4.0%浓度CSE细胞增殖能力明显增加(P≤0.01)，48h后，2.0%、4.0%和8.0%浓度细胞存活率明显下降(P≤0.01或P≤0.05)。发现经过恶性转化的细胞具有堆积增长倾向，且平板克隆形成能力增强，可以在软琼脂中形成细胞克隆，以及划痕修复能力和裸鼠成瘤能力增强等恶性细胞的特征。
结论
1从香烟选择喜好确定本次实验受试香烟；
2确认香烟提取物(CSE)的制作方法和质控方案，对16HBE细胞的急性暴露结果初步确定慢性诱导剂量。
3从细胞大体外观、平板克隆、软琼脂克隆、划痕和裸鼠成瘤实验等指标初步确认CSE具有对16HBE恶性转化能力，且建立的CSE-T细胞可作为国产香烟诱导呼吸道上皮细胞恶性转化模型。
第二部分吸烟人群血清中linc00152差异表达及对CSE诱导16HBE细胞EMT改变的影响
目前，研究证明CSE在诱导16HBE过程中发生了EMT的改变，且lncRNA可能在该过程中有一定的调控作用。因此，探讨lncRNA在CSE致16HBE细胞的EMT过程中作用，对于香烟烟雾致呼吸道上皮细胞恶性转化过程认识，以及对临床肺癌患者的肿瘤侵袭和转移等方面的机制探讨具有一定的参考意义。
方法
寻找吸烟暴露人群血清差异表达的lncRNA，再将lncRNA在肺癌细胞和肺癌组织中验证，探寻肺癌组织中lncRNA与肺癌病例特征关联。通过对E-cadherin、N-cadherin和Vimentin三种EMT标志蛋白在CSE诱导16HBE的过程中改变，再结合lncRNA干扰后，观察受试细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin改变。最后对受试细胞的转移能力进行裸鼠转移瘤模型动物验证。
结果
发现血清中linc00152的表达与人群吸烟量有关，提示linc00152可能是人群烟草暴露的标志物。结合linc00152在人群肺癌组织中的表达特征，提示可能在肺癌的转移、肿瘤生长等方面有一定的促进作用。在几种常见肺癌细胞(95D、H460、H1299和A549)以及CSE-T细胞中均呈现linc00152高表达(P≤0.01)；CSE暴露24h后，linc00152的表达随CSE浓度增高呈现表达增高(P≤0.01或P≤0.05)，linc00152在CSE诱导16HBE恶性转化中间代细胞表达依次增高(P≤0.01或P≤0.05)。
不同剂量CSE暴露16HBE，在早期(24h)受试细胞中Ecadherin的mRNA的表达随CSE暴露量的增加即出现下降(P≤0.01或P≤0.05)，不同代次CSE诱导细胞随诱导代次增加逐渐呈现Ecadherin的mRNA表达降低(P≤0.01或P≤0.05)。通过qPCR和WB实验手段，发现CSE-30P和CSE-T细胞中Ecadherin的表达明显降低(P≤0.01或P≤0.05)，同时Ncadherin和Vimentin两者表达有明显增高(P≤0.01或P≤0.05)。再将CSE-T细胞中linc00152干扰后，发现受试细胞中Ecadherin表达增高(P≤0.01)，且Ncadherin和Vimentin表达降低(P≤0.01或P≤0.05)，细胞免疫荧光测定也与该结果相一致。
将受试细胞给予裸鼠尾静脉注射后，从16d开始受试动物体重开始改变，CSE-T和NC组动物有明显的体重降低。24d后处死动物，发现主要出现肺脏转移，其余肝脏和肾脏少量转移。干扰linc00152细胞株可以减少受试细胞体内转移。
结论
1.linc00152在吸烟人群血清中高表达，可以作为香烟暴露人群血清标志物；
2linc00152在肺癌组织样本中较癌旁组织表达明显增高，通过病例样本整理，linc00152高表达与肺癌患者的吸烟习惯、以及肺癌组织大小、转移和分化等相关；
3.16HBE细胞在CSE诱导过程中发生了EMT改变，这种改变可能在CSE暴露早期已经开始；
4linc00152可能在CSE诱导16HBE细胞EMT改变过程中起促进作用，且动物体内实验证实具有促进CSE-T体内转移的能力。
第三部分linc00152对CSE-T细胞周期影响作用机制探讨
细胞的增殖失控是癌症的主要特征之一，细胞周期、凋亡的异常均与细胞的异常增殖有关。我们发现CSE-T细胞周期较对照组细胞有明显的改变，思考CSE-T细胞可能有周期调控失控导致细胞的增殖异常。目前，ceRNA(內源性竞争)作为非编码RNA在生物体内调控作用模式得到了广泛的认同。本次实验从lncRNA通过miRNA的对周期调控蛋白的作用方式，探讨linc00152在CSE-T的周期改变中可能的调控机制。
方法
通过生物信息学分析和预测，寻找linc00152下游的直接互作miRNA，以及miRNA下游的靶基因。再结合荧光素酶报告基因，验证三者之间的作用关系。再用基因干扰和共转染技术观察三者间作用关系。从细胞的周期改变观察linc00152对CSE-T和H1299的周期影响作用。再进一步通过qPCR和WB技术对cyclinD1下游周期调控通路进行验证。利用裸鼠体内实验证linc00152对CSE-T的细胞增殖调控影响作用。
结果
通过在线生物信息学网站，linc00152可能直接结合的miRNA进行预测，得到与linc00152直接作用的miR-193a-3p和miR-193b。对miR-193a-3p和miR-193b下游靶向的目的基因预测，得到两者均与CCND1关系密切程度较高。对CSE-T进行linc00152干扰，共转染和表达量比较后，提示在我们的实验体系中miR-193b在linc00152与miR-193家族的内源性竞争中占主导地位。
在肺癌细胞中linc00152和CCND1的表达之间呈现高度相关(r=0.943，P=0.005)；且在肺癌组织中linc00152和CCND1的表达呈现显著的正相关关系(r=0.712,P≤0.000)。
通过WB验证，在H1299和CSE-T两种细胞中可能存在着由linc00152内源性的竞争结合miR-193b，导致miR-193b表达下降，引起cyclinD1表达增高的现象。对细胞周期和增殖测定验证linc00152对cyclinD1的调控作用。再利用qPCR和WB方法验证了linc00152对cyclinD1下游周期蛋白通路的调控作用，以及利用构建稳转细胞株通过体内成瘤实验证实linc00152具有抑制CSE-T增殖的能力。
结论
1CSE对16HBE细胞的急性和慢性诱导后，均可以造成细胞周期改变；
2linc00152在肺癌细胞和组织中与CCND1的表达呈现显著正相关；
3linc00152可能主要通过与miR-193b(而不是miR-193a-3p)的内源性竞争作用对cyclinD1进行调控；
4linc00152主要通过对cyclinD1的调控，后者再从CDK4/CDK6/Rb/p-Rb
/E2F1途径对细胞周期产生影响，继而对受试细胞增殖和裸鼠成瘤能力造成影响。
全文结论
1.通过对16HBE细胞的香烟提取物CSE长期诱导实验，确定CSE具有使16HBE细胞恶性转化的能力，且建立的CSE-T细胞系可以作为香烟诱导呼吸道上皮细胞恶性转化的细胞模型。
2.linc00152作为吸烟人群血清中差异表达lncRNA，可以作为香烟暴露的接触标志物，且linc00152可能在CSE诱导16HBE恶性转化过程EMT过程有促进作用。
3.我们认为在CSE-T和H1299细胞中linc00152可能主要通过与miR-193b(而不是miR-193a-3p)的ceRNA作用对cyclinD1进行调控。
4.linc00152可能从“linc00152/miR193b/cyclinD1轴”对CSE-T和H1299细胞的周期调控，进而通过“CDK4/CDK6/Rb/p-Rb/E2F1轴”对CSE-T和H1299细胞周期产生影响，从而影响细胞的增殖能力。