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研究背景：
乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤之一，在国内发病率已超过宫颈癌成为女性发病率最高的癌症。其中三阴乳腺癌特指雌激素受体、孕激素受体及人表皮生长因子受体2均阴性的乳腺癌患者，占所有乳腺癌的20%1。该种肿瘤侵袭性强、预后差且复发迅速，同时缺乏适合的靶向治疗，五年生存率低至60%2，是目前治疗的难题。
近年，B7家族中PD-1/PD-L1信号通路因参与肿瘤免疫逃逸过程而备受关注，在黑色素瘤、非小细胞肺癌及膀胱瘤等肿瘤治疗上取得了突破性进展，其中三种单抗先后被FDA批准上市。在三阴乳腺癌的治疗中，PD-L1的临床前研究结果差异性大，表达率及其与预后的关系不明确，且大多是针对肿瘤细胞PD-L1的表达，免疫基质细胞上PD-L1研究较少；临床试验方面，虽有取得一定的进步、总体生存率及患者的生活质量得以提高，但PD-L1反应率低且抗PD-1/PD-L1信号通路的同时增加了诱发自身免疫的风险等因素也是目前治疗中的阻碍。
哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白mTOR(mammalian target of Rapamycin)是一种非典型的丝-苏氨酸蛋白激酶，通常以两种多蛋白复合物的形式存在，即mTORCl和mT0RC2。mTORCl被磷酸化激活后，其主要调控下游真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白(4EBP)和磷酸化核糖体40S小亚基S6蛋白激酶(p-S6K)两条通路，分别主要为mTOR/4EBP及mTOR/pS6K/pS6通路，控制转录及细胞增殖。其中mTOR/pS6k通路抑制剂应用于临床的主要有雷帕霉素及其衍生物(依维莫司、替西罗莫司等)，且依维莫司联合卡铂及依维莫司联合Eribulin用于三阴乳腺癌的治疗均已进入II期临床试验。但是实际应用中却发现单用雷帕霉素的治疗效果有限,且易产生耐药性。
目前，国内外有大量数据显示，在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肠癌及胰腺癌等的研究中，PD-L1表达对mTOR信号通路存在依赖。且有研究者分别将抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体与雷帕霉素共同作用于非小细胞肺癌及口腔癌的小鼠模型上，得到相比于单药治疗更明显的肿瘤体积缩小及生存率的提高。
乳腺癌的发生、发展不是单一基因或信号通路作用的结果，各靶点抑制剂的联合应用目前也是研究的热点。因此本课题在三阴性乳腺癌中研究PD-L1表达及其临床意义的同时探讨mTOR/pS6K信号通路与PD-L1表达的相关性，为之后可能的联合治疗提供理论、实验基础。
实验目的
1.探究三阴性乳腺癌组织中肿瘤细胞PD-L1表达与免疫基质细胞PD-L1表达的相关性。
2.统计分析三阴性乳腺癌中PD-L1表达与患者预后的关系。
3.探究三阴性乳腺癌中PD-L1及p-mTOR、p-S6K表达相关性。
4.初步探讨三阴乳腺癌细胞株上mTOR抑制剂对PD-L1表达水平的影响。
研究内容及方法：
1.免疫组化方法检测三阴乳腺癌组织标本中PD-L1及p-mTOR、p-S6K的表达。
(1)收集广州医科大学附属肿瘤医院2007年10月~2014年3月档案三阴乳腺癌石蜡标本共142例，并对相应患者的临床病理资料进行收集、整理、随访。
(2)免疫组化SP法检测三阴乳腺癌组织中PD-L1及p-mTOR、p-S6K蛋白表达，并对结果进行判读。结果判读由本课题组两位成员许晨宇及赵文立在双盲条件下进行，并邀请资深病理科医生侯敏博士予以指导。
(3)统计分析，使用SPSS22.0统计学软件进行数据分析。首先使用卡方检验对各临床病理指标与目标蛋白表达水平进行单因素分析；随后对有统计学意义的因素采用logistic回归进行关联性分析；最后使用Kaplan-Meier法进行三年无病生存率及五年无病生存率的单因素的估计，Log-rank检验进行组间生存曲线比较，运用COX回归模型进行预后的多因素分析。
2.三阴乳腺癌细胞株BT549、MDA-MB-468、MDA-MB-231及正常乳腺上皮细胞株MCF-10A的培养。
3.检测mTOR抑制剂雷帕霉素、依维莫司分别作用于三种三阴性乳腺癌细胞后对增殖的影响。
采用MTT的方法，雷帕霉素及依维莫司分为浓度梯度组及时间梯度组分别作用于三阴乳腺癌细胞，检测其对细胞增殖的影响。
4.检测mTOR抑制剂雷帕霉素及依维莫司在三阴性乳腺癌细胞株上对PD-L1表达的影响。
不同浓度雷帕霉素及依维莫司分别作用BT549细胞48小时及72小时后，使用Westernblot法测细胞总体PD-L1含量。
结果：
1.三阴乳腺癌组织标本中PD-L1及p-mTOR、pS6K的表达及对预后的影响。
三阴性乳腺癌组织中肿瘤细胞上PD-L1(简称TPD-L1)表达占25.4%，免疫基质细胞PD-L1(简称SPD-L1)表达占40.8%。p-mTOR表达与肿瘤细胞PD-L1表达及免疫基质细胞PD-L1表达呈正相关关系，p-S6K的表达仅与肿瘤细胞PD-L1表达呈正相关。TPD-L1表达、SPD-L1表达均与病理学组织分级、Ki-67表达及E-CAD表达有显著相关性，此外，SPD-L1表达与年龄也具有显著相关性。单因素分析显示肿瘤细胞PD-L1表达、免疫基质细胞PD-L1表达、p-mTOR表达、p-S6K表达及T分期、淋巴结转移、病理分级、Ki-67及E-CAD是影响患者三年无病生存的重要因素；肿瘤细胞PD-L1表达、免疫基质细胞PD-L1表达、病理分级、Ki-67及E-CAD是影响患者五年无病生存的重要因素。多因素COX回归模型分析肿瘤细胞PD-L1表达、免疫基质细胞PD-L1表达、肿瘤分期、淋巴结转移及Ki-67是影响患者三年无病生存期的独立因素，病理分级及Ki-67表达是影响患者五年无病生存的独立影响因素。
2.mTOR抑制剂可显著抑制三阴乳腺癌细胞的增殖能力。
MTT细胞增殖实验结果显示,雷帕霉素及依维莫司分别作用于三阴乳腺癌细胞株BT549、MDA-MB-468及MDA-MB-231均有抑制作用，且随着药物作用浓度的增加，其抑制作用越显著，但时间效应性不明显。其中BT549对mTOR抑制剂更为敏感。
3.mTOR抑制剂对BT549细胞上PD-L1表达的影响。
(1)雷帕霉素及依维莫司分别使用100nM及1000nM作用于BT549细胞，72h后使用Westernblot检测，结果显示100nM、1000nM雷帕霉素及依维莫司均可使细胞中PD-L1蛋白表达下调。
(2)雷帕霉素及依维莫司1000nM分别孵育BT549细胞48h及72h，Westernblot检测PD-L1在BT549细胞中的表达，结果显示雷帕霉素及依维莫司均可下调BT549中PD-L1的表达。
结论：
1.免疫基质细胞PD-L1表达与肿瘤细胞PD-L1表达具有相关性。
2.免疫基质细胞PD-L1表达及肿瘤细胞PD-L1表达均与病理学组织分级、Ki-67及E-CAD表达有显著相关性，此外，SPD-L1表达也与年龄有显著相关性。
3.p-mTOR表达与肿瘤细胞PD-L1表达及免疫基质细胞PD-L1表达呈正相关关系，p-S6K的表达仅与肿瘤细胞PD-L1表达呈正相关。
4.肿瘤细胞PD-L1表达、免疫基质细胞PD-L1表达是影响患者三年无病生存期的独立因素。
5.mTOR抑制剂对PD-L1的表达具有抑制作用。
本项目的创新之处；
1)采用免疫组化SP法检测乳腺癌组织中PD-L1及p-mTOR、p-S6K的表达相关性。
2)在三阴乳腺癌细胞株上探讨雷帕霉素、依维莫司不同浓度梯度、不同时间梯度对PD-L1表达的影响。
乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤之一，在国内发病率已超过宫颈癌成为女性发病率最高的癌症。其中三阴乳腺癌特指雌激素受体、孕激素受体及人表皮生长因子受体2均阴性的乳腺癌患者，占所有乳腺癌的20%1。该种肿瘤侵袭性强、预后差且复发迅速，同时缺乏适合的靶向治疗，五年生存率低至60%2，是目前治疗的难题。
近年，B7家族中PD-1/PD-L1信号通路因参与肿瘤免疫逃逸过程而备受关注，在黑色素瘤、非小细胞肺癌及膀胱瘤等肿瘤治疗上取得了突破性进展，其中三种单抗先后被FDA批准上市。在三阴乳腺癌的治疗中，PD-L1的临床前研究结果差异性大，表达率及其与预后的关系不明确，且大多是针对肿瘤细胞PD-L1的表达，免疫基质细胞上PD-L1研究较少；临床试验方面，虽有取得一定的进步、总体生存率及患者的生活质量得以提高，但PD-L1反应率低且抗PD-1/PD-L1信号通路的同时增加了诱发自身免疫的风险等因素也是目前治疗中的阻碍。
哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白mTOR(mammalian target of Rapamycin)是一种非典型的丝-苏氨酸蛋白激酶，通常以两种多蛋白复合物的形式存在，即mTORCl和mT0RC2。mTORCl被磷酸化激活后，其主要调控下游真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白(4EBP)和磷酸化核糖体40S小亚基S6蛋白激酶(p-S6K)两条通路，分别主要为mTOR/4EBP及mTOR/pS6K/pS6通路，控制转录及细胞增殖。其中mTOR/pS6k通路抑制剂应用于临床的主要有雷帕霉素及其衍生物(依维莫司、替西罗莫司等)，且依维莫司联合卡铂及依维莫司联合Eribulin用于三阴乳腺癌的治疗均已进入II期临床试验。但是实际应用中却发现单用雷帕霉素的治疗效果有限,且易产生耐药性。
目前，国内外有大量数据显示，在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肠癌及胰腺癌等的研究中，PD-L1表达对mTOR信号通路存在依赖。且有研究者分别将抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体与雷帕霉素共同作用于非小细胞肺癌及口腔癌的小鼠模型上，得到相比于单药治疗更明显的肿瘤体积缩小及生存率的提高。
乳腺癌的发生、发展不是单一基因或信号通路作用的结果，各靶点抑制剂的联合应用目前也是研究的热点。因此本课题在三阴性乳腺癌中研究PD-L1表达及其临床意义的同时探讨mTOR/pS6K信号通路与PD-L1表达的相关性，为之后可能的联合治疗提供理论、实验基础。
实验目的
1.探究三阴性乳腺癌组织中肿瘤细胞PD-L1表达与免疫基质细胞PD-L1表达的相关性。
2.统计分析三阴性乳腺癌中PD-L1表达与患者预后的关系。
3.探究三阴性乳腺癌中PD-L1及p-mTOR、p-S6K表达相关性。
4.初步探讨三阴乳腺癌细胞株上mTOR抑制剂对PD-L1表达水平的影响。
研究内容及方法：
1.免疫组化方法检测三阴乳腺癌组织标本中PD-L1及p-mTOR、p-S6K的表达。
(1)收集广州医科大学附属肿瘤医院2007年10月~2014年3月档案三阴乳腺癌石蜡标本共142例，并对相应患者的临床病理资料进行收集、整理、随访。
(2)免疫组化SP法检测三阴乳腺癌组织中PD-L1及p-mTOR、p-S6K蛋白表达，并对结果进行判读。结果判读由本课题组两位成员许晨宇及赵文立在双盲条件下进行，并邀请资深病理科医生侯敏博士予以指导。
(3)统计分析，使用SPSS22.0统计学软件进行数据分析。首先使用卡方检验对各临床病理指标与目标蛋白表达水平进行单因素分析；随后对有统计学意义的因素采用logistic回归进行关联性分析；最后使用Kaplan-Meier法进行三年无病生存率及五年无病生存率的单因素的估计，Log-rank检验进行组间生存曲线比较，运用COX回归模型进行预后的多因素分析。
2.三阴乳腺癌细胞株BT549、MDA-MB-468、MDA-MB-231及正常乳腺上皮细胞株MCF-10A的培养。
3.检测mTOR抑制剂雷帕霉素、依维莫司分别作用于三种三阴性乳腺癌细胞后对增殖的影响。
采用MTT的方法，雷帕霉素及依维莫司分为浓度梯度组及时间梯度组分别作用于三阴乳腺癌细胞，检测其对细胞增殖的影响。
4.检测mTOR抑制剂雷帕霉素及依维莫司在三阴性乳腺癌细胞株上对PD-L1表达的影响。
不同浓度雷帕霉素及依维莫司分别作用BT549细胞48小时及72小时后，使用Westernblot法测细胞总体PD-L1含量。
结果：
1.三阴乳腺癌组织标本中PD-L1及p-mTOR、pS6K的表达及对预后的影响。
三阴性乳腺癌组织中肿瘤细胞上PD-L1(简称TPD-L1)表达占25.4%，免疫基质细胞PD-L1(简称SPD-L1)表达占40.8%。p-mTOR表达与肿瘤细胞PD-L1表达及免疫基质细胞PD-L1表达呈正相关关系，p-S6K的表达仅与肿瘤细胞PD-L1表达呈正相关。TPD-L1表达、SPD-L1表达均与病理学组织分级、Ki-67表达及E-CAD表达有显著相关性，此外，SPD-L1表达与年龄也具有显著相关性。单因素分析显示肿瘤细胞PD-L1表达、免疫基质细胞PD-L1表达、p-mTOR表达、p-S6K表达及T分期、淋巴结转移、病理分级、Ki-67及E-CAD是影响患者三年无病生存的重要因素；肿瘤细胞PD-L1表达、免疫基质细胞PD-L1表达、病理分级、Ki-67及E-CAD是影响患者五年无病生存的重要因素。多因素COX回归模型分析肿瘤细胞PD-L1表达、免疫基质细胞PD-L1表达、肿瘤分期、淋巴结转移及Ki-67是影响患者三年无病生存期的独立因素，病理分级及Ki-67表达是影响患者五年无病生存的独立影响因素。
2.mTOR抑制剂可显著抑制三阴乳腺癌细胞的增殖能力。
MTT细胞增殖实验结果显示,雷帕霉素及依维莫司分别作用于三阴乳腺癌细胞株BT549、MDA-MB-468及MDA-MB-231均有抑制作用，且随着药物作用浓度的增加，其抑制作用越显著，但时间效应性不明显。其中BT549对mTOR抑制剂更为敏感。
3.mTOR抑制剂对BT549细胞上PD-L1表达的影响。
(1)雷帕霉素及依维莫司分别使用100nM及1000nM作用于BT549细胞，72h后使用Westernblot检测，结果显示100nM、1000nM雷帕霉素及依维莫司均可使细胞中PD-L1蛋白表达下调。
(2)雷帕霉素及依维莫司1000nM分别孵育BT549细胞48h及72h，Westernblot检测PD-L1在BT549细胞中的表达，结果显示雷帕霉素及依维莫司均可下调BT549中PD-L1的表达。
结论：
1.免疫基质细胞PD-L1表达与肿瘤细胞PD-L1表达具有相关性。
2.免疫基质细胞PD-L1表达及肿瘤细胞PD-L1表达均与病理学组织分级、Ki-67及E-CAD表达有显著相关性，此外，SPD-L1表达也与年龄有显著相关性。
3.p-mTOR表达与肿瘤细胞PD-L1表达及免疫基质细胞PD-L1表达呈正相关关系，p-S6K的表达仅与肿瘤细胞PD-L1表达呈正相关。
4.肿瘤细胞PD-L1表达、免疫基质细胞PD-L1表达是影响患者三年无病生存期的独立因素。
5.mTOR抑制剂对PD-L1的表达具有抑制作用。
本项目的创新之处；
1)采用免疫组化SP法检测乳腺癌组织中PD-L1及p-mTOR、p-S6K的表达相关性。
2)在三阴乳腺癌细胞株上探讨雷帕霉素、依维莫司不同浓度梯度、不同时间梯度对PD-L1表达的影响。