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研究背景和目的：
肝癌的发病率和死亡率呈逐年上升的趋势，据2012年统计，肝癌居人类肿瘤发病率第四位，死亡率第二位，严重影响人类的生命健康。由于早期肝癌隐匿性强不易察觉，常错过手术时机，中晚肝癌期易发生转移，这是治疗肝癌棘手的常见原因，当前虽然在肝癌的防治上取得了一些进展，但仍然未取得实质性的突破，因此寻找新的肝癌防治思路迫在眉睫。
肝脏是糖代谢的主要器官，临床上常见肝癌患者伴有糖代谢异常(即糖代谢重编程)，其主要通过糖酵解满足肿瘤细胞的快速增殖和生长。由于肿瘤糖代谢的分子机制较复杂，特别是起源于体内最大代谢器官的肝癌糖代谢调控机制远未阐明，探讨糖代谢重编程在肝癌发生中的作用，干预和修正糖代谢重编程，对于阐明肝癌致病机制和提高肝癌防治水平具有重大的意义。
生命活动的基本特征之一是细胞按一定规律不断地进行合成与分解代谢。糖分解和合成代谢平衡对于维持细胞内糖稳态具有重要作用。以往研究多关注肿瘤细胞糖分解代谢异常如有氧糖酵解，而对糖的合成代谢如糖异生却鲜见报道。因此，从―糖异生异常‖为切入点研究肿瘤细胞糖代谢重编程不但可以为阐明肿瘤代谢调控机制提供新视角，同时也将为恶性肿瘤的治疗提供新的潜在靶点。1,6，二磷酸果糖激酶1(fructose-1,6-biphosphatase 1，FBP1)是近年来肿瘤研究的重要分子。已有研究表明，FBP1参与肿瘤的发生发展，但是目前对FBP1上游信号分子或信号通路的研究鲜见报道。
二甲双胍，因治疗糖尿病效果显著，现已成为临床一线降糖药物，近年来其抗肿瘤作用受到了越来越多学者的关注，但具体作用机制尚未阐明。本课题前期的研究发现低浓度二甲双胍通过激活AMPK诱导肝癌细胞衰老而抑制肝癌细胞增殖。让我们感兴趣的是，FBP1低表达可能与肝癌细胞糖代谢重编程有关，且二甲双胍可能逆转糖代谢异常。为此，本研究拟从细胞、动物模型及临床组织标本三个层面进一步探讨FBP1在肝癌糖代谢重编程中的作用，以及二甲双胍抑制肝癌细胞增殖的分子机制，为二甲双胍抗肝癌治疗提供了理论依据及新的策略。
研究方法:
(1)葡萄糖代谢PCR芯片检测：选用肝癌细胞株Huh-7,培养至细胞状态良好时做以下处理:对照组(二甲双胍0mM/L)、实验组(二甲双胍1mM/L)，常规培养24小时后收集细胞，加入适量trizol保存于-80℃。采用葡萄糖代谢PCR芯片检测糖代谢相关基因的表达情况。
(2)培养肝癌细胞株HepG2、Huh-7、SK-HEP-1、Hep3B、PLC/PRF/5及正常肝细胞LO2，待生长态况良好时提取RNA，通过PCR分别检测几种糖异生关键酶包括果糖－1，6-二磷酸酶－1(FBP1)、葡萄糖－6-磷酸酶(G6Pase)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)的mRNA表达水平。
(3)根据(2)中检测结果，选取FBP1低表达细胞株HepG2及Huh-7，培养至细胞状态良好时做以下处理：对照组(Met 0mM/L)、实验组(Met 1mM/L)，置于细胞培养箱中持续培养24小时，后经Westernblot检测AMPK、p-AMPK、FBP1和PFK1相关分子的表达水平。
(4)建立肝癌HepG2细胞皮下移植瘤模型，按照腹腔注射药物浓度的不同处理分组为：对照组(0.9%生理盐水/kg/d)和实验组(Met250mg/kg/d)。腹腔注射干预周期为30天。30天后提取肿瘤组织，通过免疫组织化学和Westernblot检测皮下移植瘤各组中AMPK、p-AMPK、FBP1及PFK1的表达。另采用HE染色和Ki67染色检测二甲双胍对肝癌裸鼠皮下移植瘤增殖的影响。
(5)选用FBP1低表达细胞株HepG2，通过瞬时转染空白载体和FBP1过表达质粒构建FBP1过表达细胞模型，另选用(2 )中FBP1高表达细胞株Hep3b，瞬时转染ConsiRNA和AMPKsiRNA构建干扰细胞模型，持续转染48小时后均经以下方案处理：对照组(a. Met 0Mm/L，b. Met 1mM/L)和实验组(a. Met 0Mm/L，b. Met 1mM/L)，Met持续干预24小时后通过Westernblot检测AMPK、p-AMPK、FBP1相关分子的表达水平。
(6)选用(2)中FBP1低表达细胞株HepG2及Huh-7构建FBP1稳定过表达细胞，另选用(2)中FBP1高表达细胞株通过瞬时转染构建FBP1敲低细胞模型，通过Westernblot验证FBP1过表达和敲低细胞模型的成功建立，检测FBP1过表达和敲低细胞模型中糖消耗水平及乳酸的含量。
(7)采用(6)中FBP1过表达和敲低细胞模型，通过MTS和克隆形成实验检测FBP1过表达和敲低对肝癌细胞增殖的影响。
(8)随机挑取61例在2008年至2011年间肝癌术后患者石蜡标本，通过免疫组织化学实验检测FBP1在肝癌术后患者病理组织中的表达水平，查询该61例肝癌术后患者临床相关资料，并通过电话随访了解患者术后生存情况，分析FBP1的表达水平与肝癌术后临床病理参数和预后的相关关系。
实验结果：
(1)葡萄糖代谢PCR芯片结果显示:与对照组相比，实验组FBP1mRNA表达水平显著升高(P＜0.05)。结果提示，二甲双胍可能诱导FBP1mRNA表达水平上调。
(2)PCR检测结果提示，糖异生关键酶果糖－1，6-二磷酸酶－1(FBP1)、葡萄糖－6-磷酸酶(G6Pase)、和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)在大多数肝癌细胞中低表达。
(3)Westernblot检测结果表明：与对照组相比，实验组中p-AMPK、FBP1表达升高，但糖酵解关键酶PFK1表达降低，而AMPK表达无明显变化。结果提示，二甲双胍可能通过激活AMPK上调FBP1表达。
(4)免疫组织化学染色结果表明，二甲双胍可以显著上调肝癌裸鼠皮下移植瘤中p-AMPK和FBP1的表达(P＜0.05)以及下调PFK1的表达(P＜0.05)，但AMPK无明显变化；Westernblot检测结果与免疫组化结果一致，初步提示二甲双胍可能抑制肝癌糖酵解和促进糖异生。HE染色和Ki67染色结果均显示二甲双胍抑制肝癌裸鼠皮下移植瘤的增殖。
(5)为了进一步验证AMPK是否是FBP1的上游调控分子，在低表达FBP1的肝癌细胞HepG2中瞬时转染FBP1过表达质粒后,过Westernblot检测发现,FBP1表达明显升高，但AMPK及p-AMPK蛋白表达水平与对照组比较均无明显差异，加入二甲双胍干预后FBP1和p-AMPK表达上调，AMPK无明显变化。Hep3b肝癌细胞经转染AMPKsiRNA后，与对照组相比，AMPK、p-AMPK、FBP1蛋白表达水平均明显下降，加入二甲双胍干预后FBP1和p-AMPK表达上调，AMPK无明显变化。结果表明二甲双胍通过激活AMPK诱导FBP1表达水平上调。
(6)通过Westernblot验证FBP1过表达和敲低细胞模型已成功建立。后通过相关试剂盒检测FBP1过表达和敲低对肝癌细胞糖消耗水平和乳酸含量的影响。结果显示：在FBP1过表达细胞HepG2和Huh-7中，与对照组相比，FBP1过表达后糖消耗水平和乳酸浓度均明显降低(P＜0.05)；FBP1敲低细胞Hep3b模型中，与对照组相比，FBP1敲低后糖消耗和水平和乳酸含量均明显升高(P＜0.05)。结果表明FBP1可以显著降低肝癌细胞的糖消耗水平和乳酸含量。(7)通过MTS和克隆形成实验检测FBP1对肝癌细胞增殖的影响，结果显示，与对照组相比，FBP1过表达肝癌细胞的增殖能力显著降低(p＜0.05)，FBP1敲低后肝癌细胞的生长与增殖能力显著增强(p＜0.05)。结果表明FBP1可以抑制肝癌细胞增殖。
(8)免疫组织化学检测结果显示：61例肝癌患者组织标本中，FBP1低表达患者41例，高表达20例，低表达率67.2%。结果显示，FBP1与肝癌术后患者的性别、年龄无相关性，和临床分期、分化程度和淋巴结转移均密切相关，并且与FBP1低表达患者相比，FBP1高表达肝癌术后患者的生存期显著升高。
实验结论：
(1)二甲双胍通过促进糖异生抑制肝癌细胞增殖
(2)活化的AMPK通过诱导FBP1表达上调抑制肝癌细胞增殖
肝癌的发病率和死亡率呈逐年上升的趋势，据2012年统计，肝癌居人类肿瘤发病率第四位，死亡率第二位，严重影响人类的生命健康。由于早期肝癌隐匿性强不易察觉，常错过手术时机，中晚肝癌期易发生转移，这是治疗肝癌棘手的常见原因，当前虽然在肝癌的防治上取得了一些进展，但仍然未取得实质性的突破，因此寻找新的肝癌防治思路迫在眉睫。
肝脏是糖代谢的主要器官，临床上常见肝癌患者伴有糖代谢异常(即糖代谢重编程)，其主要通过糖酵解满足肿瘤细胞的快速增殖和生长。由于肿瘤糖代谢的分子机制较复杂，特别是起源于体内最大代谢器官的肝癌糖代谢调控机制远未阐明，探讨糖代谢重编程在肝癌发生中的作用，干预和修正糖代谢重编程，对于阐明肝癌致病机制和提高肝癌防治水平具有重大的意义。
生命活动的基本特征之一是细胞按一定规律不断地进行合成与分解代谢。糖分解和合成代谢平衡对于维持细胞内糖稳态具有重要作用。以往研究多关注肿瘤细胞糖分解代谢异常如有氧糖酵解，而对糖的合成代谢如糖异生却鲜见报道。因此，从―糖异生异常‖为切入点研究肿瘤细胞糖代谢重编程不但可以为阐明肿瘤代谢调控机制提供新视角，同时也将为恶性肿瘤的治疗提供新的潜在靶点。1,6，二磷酸果糖激酶1(fructose-1,6-biphosphatase 1，FBP1)是近年来肿瘤研究的重要分子。已有研究表明，FBP1参与肿瘤的发生发展，但是目前对FBP1上游信号分子或信号通路的研究鲜见报道。
二甲双胍，因治疗糖尿病效果显著，现已成为临床一线降糖药物，近年来其抗肿瘤作用受到了越来越多学者的关注，但具体作用机制尚未阐明。本课题前期的研究发现低浓度二甲双胍通过激活AMPK诱导肝癌细胞衰老而抑制肝癌细胞增殖。让我们感兴趣的是，FBP1低表达可能与肝癌细胞糖代谢重编程有关，且二甲双胍可能逆转糖代谢异常。为此，本研究拟从细胞、动物模型及临床组织标本三个层面进一步探讨FBP1在肝癌糖代谢重编程中的作用，以及二甲双胍抑制肝癌细胞增殖的分子机制，为二甲双胍抗肝癌治疗提供了理论依据及新的策略。
研究方法:
(1)葡萄糖代谢PCR芯片检测：选用肝癌细胞株Huh-7,培养至细胞状态良好时做以下处理:对照组(二甲双胍0mM/L)、实验组(二甲双胍1mM/L)，常规培养24小时后收集细胞，加入适量trizol保存于-80℃。采用葡萄糖代谢PCR芯片检测糖代谢相关基因的表达情况。
(2)培养肝癌细胞株HepG2、Huh-7、SK-HEP-1、Hep3B、PLC/PRF/5及正常肝细胞LO2，待生长态况良好时提取RNA，通过PCR分别检测几种糖异生关键酶包括果糖－1，6-二磷酸酶－1(FBP1)、葡萄糖－6-磷酸酶(G6Pase)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)的mRNA表达水平。
(3)根据(2)中检测结果，选取FBP1低表达细胞株HepG2及Huh-7，培养至细胞状态良好时做以下处理：对照组(Met 0mM/L)、实验组(Met 1mM/L)，置于细胞培养箱中持续培养24小时，后经Westernblot检测AMPK、p-AMPK、FBP1和PFK1相关分子的表达水平。
(4)建立肝癌HepG2细胞皮下移植瘤模型，按照腹腔注射药物浓度的不同处理分组为：对照组(0.9%生理盐水/kg/d)和实验组(Met250mg/kg/d)。腹腔注射干预周期为30天。30天后提取肿瘤组织，通过免疫组织化学和Westernblot检测皮下移植瘤各组中AMPK、p-AMPK、FBP1及PFK1的表达。另采用HE染色和Ki67染色检测二甲双胍对肝癌裸鼠皮下移植瘤增殖的影响。
(5)选用FBP1低表达细胞株HepG2，通过瞬时转染空白载体和FBP1过表达质粒构建FBP1过表达细胞模型，另选用(2 )中FBP1高表达细胞株Hep3b，瞬时转染ConsiRNA和AMPKsiRNA构建干扰细胞模型，持续转染48小时后均经以下方案处理：对照组(a. Met 0Mm/L，b. Met 1mM/L)和实验组(a. Met 0Mm/L，b. Met 1mM/L)，Met持续干预24小时后通过Westernblot检测AMPK、p-AMPK、FBP1相关分子的表达水平。
(6)选用(2)中FBP1低表达细胞株HepG2及Huh-7构建FBP1稳定过表达细胞，另选用(2)中FBP1高表达细胞株通过瞬时转染构建FBP1敲低细胞模型，通过Westernblot验证FBP1过表达和敲低细胞模型的成功建立，检测FBP1过表达和敲低细胞模型中糖消耗水平及乳酸的含量。
(7)采用(6)中FBP1过表达和敲低细胞模型，通过MTS和克隆形成实验检测FBP1过表达和敲低对肝癌细胞增殖的影响。
(8)随机挑取61例在2008年至2011年间肝癌术后患者石蜡标本，通过免疫组织化学实验检测FBP1在肝癌术后患者病理组织中的表达水平，查询该61例肝癌术后患者临床相关资料，并通过电话随访了解患者术后生存情况，分析FBP1的表达水平与肝癌术后临床病理参数和预后的相关关系。
实验结果：
(1)葡萄糖代谢PCR芯片结果显示:与对照组相比，实验组FBP1mRNA表达水平显著升高(P＜0.05)。结果提示，二甲双胍可能诱导FBP1mRNA表达水平上调。
(2)PCR检测结果提示，糖异生关键酶果糖－1，6-二磷酸酶－1(FBP1)、葡萄糖－6-磷酸酶(G6Pase)、和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)在大多数肝癌细胞中低表达。
(3)Westernblot检测结果表明：与对照组相比，实验组中p-AMPK、FBP1表达升高，但糖酵解关键酶PFK1表达降低，而AMPK表达无明显变化。结果提示，二甲双胍可能通过激活AMPK上调FBP1表达。
(4)免疫组织化学染色结果表明，二甲双胍可以显著上调肝癌裸鼠皮下移植瘤中p-AMPK和FBP1的表达(P＜0.05)以及下调PFK1的表达(P＜0.05)，但AMPK无明显变化；Westernblot检测结果与免疫组化结果一致，初步提示二甲双胍可能抑制肝癌糖酵解和促进糖异生。HE染色和Ki67染色结果均显示二甲双胍抑制肝癌裸鼠皮下移植瘤的增殖。
(5)为了进一步验证AMPK是否是FBP1的上游调控分子，在低表达FBP1的肝癌细胞HepG2中瞬时转染FBP1过表达质粒后,过Westernblot检测发现,FBP1表达明显升高，但AMPK及p-AMPK蛋白表达水平与对照组比较均无明显差异，加入二甲双胍干预后FBP1和p-AMPK表达上调，AMPK无明显变化。Hep3b肝癌细胞经转染AMPKsiRNA后，与对照组相比，AMPK、p-AMPK、FBP1蛋白表达水平均明显下降，加入二甲双胍干预后FBP1和p-AMPK表达上调，AMPK无明显变化。结果表明二甲双胍通过激活AMPK诱导FBP1表达水平上调。
(6)通过Westernblot验证FBP1过表达和敲低细胞模型已成功建立。后通过相关试剂盒检测FBP1过表达和敲低对肝癌细胞糖消耗水平和乳酸含量的影响。结果显示：在FBP1过表达细胞HepG2和Huh-7中，与对照组相比，FBP1过表达后糖消耗水平和乳酸浓度均明显降低(P＜0.05)；FBP1敲低细胞Hep3b模型中，与对照组相比，FBP1敲低后糖消耗和水平和乳酸含量均明显升高(P＜0.05)。结果表明FBP1可以显著降低肝癌细胞的糖消耗水平和乳酸含量。(7)通过MTS和克隆形成实验检测FBP1对肝癌细胞增殖的影响，结果显示，与对照组相比，FBP1过表达肝癌细胞的增殖能力显著降低(p＜0.05)，FBP1敲低后肝癌细胞的生长与增殖能力显著增强(p＜0.05)。结果表明FBP1可以抑制肝癌细胞增殖。
(8)免疫组织化学检测结果显示：61例肝癌患者组织标本中，FBP1低表达患者41例，高表达20例，低表达率67.2%。结果显示，FBP1与肝癌术后患者的性别、年龄无相关性，和临床分期、分化程度和淋巴结转移均密切相关，并且与FBP1低表达患者相比，FBP1高表达肝癌术后患者的生存期显著升高。
实验结论：
(1)二甲双胍通过促进糖异生抑制肝癌细胞增殖
(2)活化的AMPK通过诱导FBP1表达上调抑制肝癌细胞增殖