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目的:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的肝癌，因其缺乏早期诊断方法和有效的治疗手段一直以其高发病率和高死亡率而备受关注。HCC的发生发展是一个多因素参与的复杂调控过程，其分子机制有待进一步阐明。长链非编码RNA(10ng non-coding RNA，lncRNAs)是指长度大于200个核苷酸(nucleotide，nt)同时不能编码蛋白质的转录本。LncRNAs起初被认为是转录副产物甚至被当作转录“垃圾”，越来越多的研究发现lncRNAs参与了许多疾病的发生发展，包括HCC。因此，寻找HCC中异常表达的lncRNAs，研究其对肝癌细胞生物学行为的影响及调控关系，有利于阐明HCC的发病机制，对HCC的早期诊断和靶向治疗具有重要意义。
方法:利用基因芯片技术检测3例HCC癌组织和癌旁组织中lncRNAs的表达，筛选差异表达的lncRNAs。运用实时荧光定量PCR(qualltitative real-time PCR，qR-T-PCR)技术检测lncRNA UBE2CP3在46例HCC癌组织和癌旁组织的表达水平，利用原位杂交(in situ hybridization，ISH)技术检测lncRNA UBE2PC3在85例HCC癌组织和癌旁组织的表达水平，分析lncRNA UBE2CP3表达量与临床病理特征的相关性。通过稳定过表达和稳定干扰lncRNA UBE2CP3在肝癌细胞中的表达，研究lncRNA UBE2CP3在体外对肝癌细胞迁移与侵袭的影响，构建裸鼠转移模型观察lncRNA UBE2CP3在体内对肝癌细胞转移能力的影响。通过qRT-PCR和westem blot技术检测肝癌细胞与肝癌组织中上皮间质转化(epithelial-mesenchymal tmsition，EMT)关键基因的表达情况，探讨lncRNA UBE2CP3促进HCC侵袭迁移的具体机制。通过qRT-PCR检测HCC患者与健康对照者血清中lncRNA UBE2CP3的表达，比较HCC手术患者术前术后1ncRNA UBE2CP3的表达情况。
结果:在3例经病理确诊为中分化HCC的肝癌组织和其相应的癌旁组织标本中进行lncRNAs表达谱芯片分析，经生物信息学分析，筛选得到癌组织和癌旁组织中差异表达大于1.5倍且P＜0.05的lncRNAs共722个，其中513个lncRNAs表达上调，209个lncRNAs表达下调。在差异表达的lncRNAs中，lncRNA UBE2CP3在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织，差异表达倍数为11.58，P=0.0091。芯片结果上传于GEO网站，序列号为GSE89186(htqp://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE89186)。
通过qRT-PCR验证lncRNA UBE2CP3在46例肝癌组织和配对癌旁组织中的表达水平，结果显示lncRNAUBE2CP3在肝癌组织中明显表达上调，与芯片结果一致。运用ISH技术在85例肝癌组织和配对癌旁组织中检测lncRNA UBE2CP3的表达水平，结果与qRT-PCR相一致。通过对lncRNA UBE2CP3表达量和131例HCC患者的临床资料进行分析，我们发现lncRNA UBE2CP3表达量与HCC患者Edmondson分级、吸烟和饮酒相关，而与性别、AFP水平、肝硬化情况、HBsAg、肿瘤个数等无明显相关。对队列2中85例病人随访资料分析发现，lncRNAUBE2CP3高表达患者的生存时间较lncRNAUBE2CP3低表达患者的生存时间短，lncRNAUBE2CP3的表达与HCC患者预后具有一定的相关性。Cox比例风险回归模型进行单因素及多因素分析结果表明lncRNA UBE2CP3表达(P=0.001)，病理分级(P=0.015)，肿瘤大小(P=0.012)是肝癌患者预后不良的因素。Cox逐步回归多因素分析结果表明lncRNA UBE2CP3表达(P=0.006)可以作为预测肝癌患者不良预后的独立危险因素。
为了研究lncRNA UBE2CP3对肝癌细胞生物学行为的影响，我们成功构建了稳定过表达和干扰lncRNA UBE2CP3的HepG2和SMMC-7721肝癌细胞株。划痕实验和trans-well迁移实验结果表明lncRNA UBE2CP3能够促进肝癌细胞的迁移能力，trans-well侵袭实验表明lncRNA UBE2CP3能够明显增强肝癌细胞的侵袭能力。裸鼠肝转移模型实验表明lncRNA UBE2CP3能够促进体内肝癌细胞的转移。
EMT是影响细胞迁移和侵袭能力的一个重要方面。我们对EMT关键基因进行qRT-PCR和westem blot检测，结果显示lncRNA UBE2CP3促进转录因子Snaill、间质标志物N-cadherin的表达，降低上皮标志物E-cadherin的表达。我们运用qRT-PCR在36对肝细胞癌和相应的癌旁组织中对Snaill、E-cadherin和N-cadherin的表达水平进行检测，结果提示与癌旁组织相比，肝细胞癌组织中Snaill和N-cadherin的表达水平明显升高，而E-cadherin的表达水平则明显下降。对裸鼠肝转移模型实验中裸鼠肝组织进行免疫组化检测，实验结果显示过表达lncRNAUBE2CP3组中E-cadherin的表达明显比对照降低，而N-cadherin的表达则明显升高。在干扰lncRNAUBE2CP3组中，与对照组相比，其E-cadherin的表达明显升高，而N-cadherin的表达则下降。
收集75例健康对照者和80例确诊为肝细胞癌患者的血清，经qRT-PCR检测发现lncRNA UBE2CP3在肝细胞癌患者中的表达水平明显高于健康对照者，同时绘制受试者特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线，其曲线下面积(Area under the curve，AUC)为0.893(95％CI:0.779-0.899)，联合AFP和lncRNA UBE2CP3所得到的ROC曲线下面积为0.933(95％CI:0.897-0.969)，由此可以看出联合后的AUC要略高于单独用lncRNAUBE2CP3诊断时的AUC，提示lncRNA UBE2CP3可能对于肝细胞癌的诊断具有一定的价值。此外，收集40例确诊为HCC且进行手术切除患者的术前血清及术后10天血清，经qRT-PCR检测发现HCC患者术后lncRNA UBE2CP3的表达水平明低于手术前患者。
结论:LncRNA UBE2CP3在HCC癌组织中明显升高。LncRNA在体内外均能促进肝癌细胞的侵袭迁移。LncRNA UBE2CP3能够上调Snaill和N-cadherin的表达，抑制E-cadherin的表达，促进EMT的发生。HCC患者血清lncRNA UBE2CP3水平明显升高，术后lncRNAUBE2CP3较术前降低。总而言之，lncRNA UBE2CP3促进HCC的发生发展，血清lncRNA UBE2CP3有望成为诊断HCC的新型生物标志物。
方法:利用基因芯片技术检测3例HCC癌组织和癌旁组织中lncRNAs的表达，筛选差异表达的lncRNAs。运用实时荧光定量PCR(qualltitative real-time PCR，qR-T-PCR)技术检测lncRNA UBE2CP3在46例HCC癌组织和癌旁组织的表达水平，利用原位杂交(in situ hybridization，ISH)技术检测lncRNA UBE2PC3在85例HCC癌组织和癌旁组织的表达水平，分析lncRNA UBE2CP3表达量与临床病理特征的相关性。通过稳定过表达和稳定干扰lncRNA UBE2CP3在肝癌细胞中的表达，研究lncRNA UBE2CP3在体外对肝癌细胞迁移与侵袭的影响，构建裸鼠转移模型观察lncRNA UBE2CP3在体内对肝癌细胞转移能力的影响。通过qRT-PCR和westem blot技术检测肝癌细胞与肝癌组织中上皮间质转化(epithelial-mesenchymal tmsition，EMT)关键基因的表达情况，探讨lncRNA UBE2CP3促进HCC侵袭迁移的具体机制。通过qRT-PCR检测HCC患者与健康对照者血清中lncRNA UBE2CP3的表达，比较HCC手术患者术前术后1ncRNA UBE2CP3的表达情况。
结果:在3例经病理确诊为中分化HCC的肝癌组织和其相应的癌旁组织标本中进行lncRNAs表达谱芯片分析，经生物信息学分析，筛选得到癌组织和癌旁组织中差异表达大于1.5倍且P＜0.05的lncRNAs共722个，其中513个lncRNAs表达上调，209个lncRNAs表达下调。在差异表达的lncRNAs中，lncRNA UBE2CP3在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织，差异表达倍数为11.58，P=0.0091。芯片结果上传于GEO网站，序列号为GSE89186(htqp://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE89186)。
通过qRT-PCR验证lncRNA UBE2CP3在46例肝癌组织和配对癌旁组织中的表达水平，结果显示lncRNAUBE2CP3在肝癌组织中明显表达上调，与芯片结果一致。运用ISH技术在85例肝癌组织和配对癌旁组织中检测lncRNA UBE2CP3的表达水平，结果与qRT-PCR相一致。通过对lncRNA UBE2CP3表达量和131例HCC患者的临床资料进行分析，我们发现lncRNA UBE2CP3表达量与HCC患者Edmondson分级、吸烟和饮酒相关，而与性别、AFP水平、肝硬化情况、HBsAg、肿瘤个数等无明显相关。对队列2中85例病人随访资料分析发现，lncRNAUBE2CP3高表达患者的生存时间较lncRNAUBE2CP3低表达患者的生存时间短，lncRNAUBE2CP3的表达与HCC患者预后具有一定的相关性。Cox比例风险回归模型进行单因素及多因素分析结果表明lncRNA UBE2CP3表达(P=0.001)，病理分级(P=0.015)，肿瘤大小(P=0.012)是肝癌患者预后不良的因素。Cox逐步回归多因素分析结果表明lncRNA UBE2CP3表达(P=0.006)可以作为预测肝癌患者不良预后的独立危险因素。
为了研究lncRNA UBE2CP3对肝癌细胞生物学行为的影响，我们成功构建了稳定过表达和干扰lncRNA UBE2CP3的HepG2和SMMC-7721肝癌细胞株。划痕实验和trans-well迁移实验结果表明lncRNA UBE2CP3能够促进肝癌细胞的迁移能力，trans-well侵袭实验表明lncRNA UBE2CP3能够明显增强肝癌细胞的侵袭能力。裸鼠肝转移模型实验表明lncRNA UBE2CP3能够促进体内肝癌细胞的转移。
EMT是影响细胞迁移和侵袭能力的一个重要方面。我们对EMT关键基因进行qRT-PCR和westem blot检测，结果显示lncRNA UBE2CP3促进转录因子Snaill、间质标志物N-cadherin的表达，降低上皮标志物E-cadherin的表达。我们运用qRT-PCR在36对肝细胞癌和相应的癌旁组织中对Snaill、E-cadherin和N-cadherin的表达水平进行检测，结果提示与癌旁组织相比，肝细胞癌组织中Snaill和N-cadherin的表达水平明显升高，而E-cadherin的表达水平则明显下降。对裸鼠肝转移模型实验中裸鼠肝组织进行免疫组化检测，实验结果显示过表达lncRNAUBE2CP3组中E-cadherin的表达明显比对照降低，而N-cadherin的表达则明显升高。在干扰lncRNAUBE2CP3组中，与对照组相比，其E-cadherin的表达明显升高，而N-cadherin的表达则下降。
收集75例健康对照者和80例确诊为肝细胞癌患者的血清，经qRT-PCR检测发现lncRNA UBE2CP3在肝细胞癌患者中的表达水平明显高于健康对照者，同时绘制受试者特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线，其曲线下面积(Area under the curve，AUC)为0.893(95％CI:0.779-0.899)，联合AFP和lncRNA UBE2CP3所得到的ROC曲线下面积为0.933(95％CI:0.897-0.969)，由此可以看出联合后的AUC要略高于单独用lncRNAUBE2CP3诊断时的AUC，提示lncRNA UBE2CP3可能对于肝细胞癌的诊断具有一定的价值。此外，收集40例确诊为HCC且进行手术切除患者的术前血清及术后10天血清，经qRT-PCR检测发现HCC患者术后lncRNA UBE2CP3的表达水平明低于手术前患者。
结论:LncRNA UBE2CP3在HCC癌组织中明显升高。LncRNA在体内外均能促进肝癌细胞的侵袭迁移。LncRNA UBE2CP3能够上调Snaill和N-cadherin的表达，抑制E-cadherin的表达，促进EMT的发生。HCC患者血清lncRNA UBE2CP3水平明显升高，术后lncRNAUBE2CP3较术前降低。总而言之，lncRNA UBE2CP3促进HCC的发生发展，血清lncRNA UBE2CP3有望成为诊断HCC的新型生物标志物。