论文部分内容阅读
上皮性卵巢癌(EOC)是高发且死亡率占第一位的妇科肿瘤。耐药复发是导致EOC治疗失败的主要原因，而肿瘤干细胞(CSC)被认为与耐药复发密切相关。探明CSC的标志物及其与耐药的相关机制具有重要意义。酰基甘油激酶(AGK)是一类新发现的脂类激酶，在多种恶性肿瘤中高表达，如宫颈鳞癌、子宫内膜腺癌及乳腺癌等。发现AGK在上皮性卵巢癌中高表达，且表达水平与上皮性卵巢癌患者的生存预后明显相关。因此，本研究旨在探讨AGK在上皮性卵巢癌细胞和上皮性卵巢癌干细胞中的生物学功能及分子机制。
研究目的：
1.观察AGK在EOC中的表达情况;
2.分析EOC中AGK的表达水平与患者临床病理特征和生存预后的相关性;
3.研究AGK对EOC细胞增殖的影响作用;
4.研究内源性AGK对EOC干细胞亚群的影响作用;
5.探讨内源性AGK调节EOC细胞增殖及对干细胞亚群影响的分子机制。
研究方法：
1.采用基因表达谱芯片技术，对6对EOC癌组织及癌旁正常组织基因表达谱进行分析，初步观察AGK在EOC中的表达的情况;
2.采用qRT-PCR和Western blotting实验，在1株人正常卵巢上皮细胞、6株人卵巢癌细胞系中、4个患者配对的EOC组织及瘤旁非癌组织中初步观察AGK表达的情况;
3.通过IHC实验，分析有临床资料的140例EOC患者的石蜡包埋切片，了解AGK蛋白的表达水平：
4.利用SPSS17.0分析AGK蛋白的表达水平与EOC患者临床病理特征及预后生存的关系;
5.建立高表达及沉默内源性AGK的稳定EOC细胞株;
6.体外实验通过免疫荧光、细胞生长曲线、平板克隆形成实验、EDU实验检测AGK对EOC细胞增殖的影响;
7.通过裸鼠成瘤实验检测AGK对EOC细胞体内形成肿瘤能力的影响：
8.通过qRT-PCR实验和Western blotting实验，分别检测p21、p27、cyclinD1、Rb等多种细胞周期相关蛋白的表达情况;
9.利用qRT-PCR检测多能性相关标记物的表达水平：利用球囊形成实验检测细胞的自我更新能力;利用细胞流式分析侧群细胞(SP)的比例检测AGK对EOC细胞干细胞亚群增殖和干细胞样表型的影响;
10.利用基因表达谱芯片技术分析过表达及沉默内源性AGK的8株EOC细胞，检测在AGK表达水平发生变化后相关基因表达谱的变化;
11.利用AGK-BioID技术筛选EOC细胞中与AGK相互作用的蛋白，进一步筛选并验证可能所在的信号通路。
研究结果：
1.基因表达谱芯片结果显示AGK在上皮性卵巢癌组织中高表达。
2.实验结果显示，相对于1株正常EOC细胞，AGK的mRNA和蛋白的表达水平在6株EOC细胞系中均显著升高;4名患者的配对的EOC癌组织中AGK的mRNA和蛋白表达水平明显高于瘤旁非癌组织：
3.AGK蛋白高表达与EOC患者FIGO分期(P=0.002)、腹水量(P=O.001)和腹水细胞学阳性（P=O.004）相关：Kaplan-Meier生存分析和Log-rank检验显示，AGK蛋白表达水平与EOC患者的生存预后密切相关（P＜0.05）;
4.单因素和多因素方差分析显示，FIGO分期、AGK蛋白的表达水平可作为影响EOC预后的独立危险因素：
5.细胞生长曲线、平板克隆实验显示，高表达AGK的EOC细胞OVCAR3和CAOV3生长速度明显快于对照组细胞，而沉默内源性AGK的EOC细胞的生长速度明显慢于对照组细胞;
6.EDU掺入实验表明，高表达AGK的EOC细胞中EDU的掺入量增多，而沉默内源性AGK的EOC细胞中EDU的掺入量减少;
7.体内裸鼠实验表明OVCAR3-AGK细胞的成瘤能力要明显高于对照组细胞，而OVCAR3-AGK-RNAi细胞的成瘤能力要明显低于对照组细胞：
8.高表达AGK促进细胞周期素cyclinD1及pRb的表达，抑制细胞周期抑制因子p2lCip1和p27Kip1的表达，而沉默内源性AGK则抑制细胞周期素cyclinD1及pRb的表达，促进细胞周期抑制因子p21Cip1和p27Kip1的表达;
9.高表达AGK增强EOC细胞的球囊形成能力，增加EOC细胞中SP+细胞的比例，并提高多能性相关标记物的表达水平;
10.AGK与RPL39蛋白相互作用。
研究结论：
1.AGK在EOC中高表达。AGK的表达与EOC患者的临床病理特征相关，并且影响EOC患者的生存预后;
2.AGK促进EOC细胞增殖;
3.AGK促进EOC干细胞亚群的增殖并增强干细胞样表型;
4.AGK与RPL39蛋白相互作用;
5.AGK具成为EOC的新诊断标志物和新治疗靶标的潜力;
6.AGK具成为EOC干细胞生物标志物的潜力。
研究目的：
1.观察AGK在EOC中的表达情况;
2.分析EOC中AGK的表达水平与患者临床病理特征和生存预后的相关性;
3.研究AGK对EOC细胞增殖的影响作用;
4.研究内源性AGK对EOC干细胞亚群的影响作用;
5.探讨内源性AGK调节EOC细胞增殖及对干细胞亚群影响的分子机制。
研究方法：
1.采用基因表达谱芯片技术，对6对EOC癌组织及癌旁正常组织基因表达谱进行分析，初步观察AGK在EOC中的表达的情况;
2.采用qRT-PCR和Western blotting实验，在1株人正常卵巢上皮细胞、6株人卵巢癌细胞系中、4个患者配对的EOC组织及瘤旁非癌组织中初步观察AGK表达的情况;
3.通过IHC实验，分析有临床资料的140例EOC患者的石蜡包埋切片，了解AGK蛋白的表达水平：
4.利用SPSS17.0分析AGK蛋白的表达水平与EOC患者临床病理特征及预后生存的关系;
5.建立高表达及沉默内源性AGK的稳定EOC细胞株;
6.体外实验通过免疫荧光、细胞生长曲线、平板克隆形成实验、EDU实验检测AGK对EOC细胞增殖的影响;
7.通过裸鼠成瘤实验检测AGK对EOC细胞体内形成肿瘤能力的影响：
8.通过qRT-PCR实验和Western blotting实验，分别检测p21、p27、cyclinD1、Rb等多种细胞周期相关蛋白的表达情况;
9.利用qRT-PCR检测多能性相关标记物的表达水平：利用球囊形成实验检测细胞的自我更新能力;利用细胞流式分析侧群细胞(SP)的比例检测AGK对EOC细胞干细胞亚群增殖和干细胞样表型的影响;
10.利用基因表达谱芯片技术分析过表达及沉默内源性AGK的8株EOC细胞，检测在AGK表达水平发生变化后相关基因表达谱的变化;
11.利用AGK-BioID技术筛选EOC细胞中与AGK相互作用的蛋白，进一步筛选并验证可能所在的信号通路。
研究结果：
1.基因表达谱芯片结果显示AGK在上皮性卵巢癌组织中高表达。
2.实验结果显示，相对于1株正常EOC细胞，AGK的mRNA和蛋白的表达水平在6株EOC细胞系中均显著升高;4名患者的配对的EOC癌组织中AGK的mRNA和蛋白表达水平明显高于瘤旁非癌组织：
3.AGK蛋白高表达与EOC患者FIGO分期(P=0.002)、腹水量(P=O.001)和腹水细胞学阳性（P=O.004）相关：Kaplan-Meier生存分析和Log-rank检验显示，AGK蛋白表达水平与EOC患者的生存预后密切相关（P＜0.05）;
4.单因素和多因素方差分析显示，FIGO分期、AGK蛋白的表达水平可作为影响EOC预后的独立危险因素：
5.细胞生长曲线、平板克隆实验显示，高表达AGK的EOC细胞OVCAR3和CAOV3生长速度明显快于对照组细胞，而沉默内源性AGK的EOC细胞的生长速度明显慢于对照组细胞;
6.EDU掺入实验表明，高表达AGK的EOC细胞中EDU的掺入量增多，而沉默内源性AGK的EOC细胞中EDU的掺入量减少;
7.体内裸鼠实验表明OVCAR3-AGK细胞的成瘤能力要明显高于对照组细胞，而OVCAR3-AGK-RNAi细胞的成瘤能力要明显低于对照组细胞：
8.高表达AGK促进细胞周期素cyclinD1及pRb的表达，抑制细胞周期抑制因子p2lCip1和p27Kip1的表达，而沉默内源性AGK则抑制细胞周期素cyclinD1及pRb的表达，促进细胞周期抑制因子p21Cip1和p27Kip1的表达;
9.高表达AGK增强EOC细胞的球囊形成能力，增加EOC细胞中SP+细胞的比例，并提高多能性相关标记物的表达水平;
10.AGK与RPL39蛋白相互作用。
研究结论：
1.AGK在EOC中高表达。AGK的表达与EOC患者的临床病理特征相关，并且影响EOC患者的生存预后;
2.AGK促进EOC细胞增殖;
3.AGK促进EOC干细胞亚群的增殖并增强干细胞样表型;
4.AGK与RPL39蛋白相互作用;
5.AGK具成为EOC的新诊断标志物和新治疗靶标的潜力;
6.AGK具成为EOC干细胞生物标志物的潜力。