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肿瘤细胞发生转移是导致癌症患者死亡的重要原因之一。肿瘤转移主要包括肿瘤细胞从原位逃逸、浸润、穿过血管或淋巴管，在管腔内转移，定位远处器官，并在远端定位处增殖等一系列过程。其中，肿瘤细胞通过营造具有自身特点的肿瘤微环境，进而帮助肿瘤细胞突破血管屏障进入血液循环系统，是肿瘤细胞发生转移的关键步骤之一。肿瘤微环境中包含肿瘤细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞等，这些细胞之间可以直接相互作用，也可以通过分泌囊泡、蛋白核酸分子发生间接作用。肿瘤细胞来源的外泌体是肿瘤微环境中细胞外囊泡的一种，含有蛋白质、核酸等细胞代谢和组成成分，在肿瘤浸润过程中对肿瘤微环境的塑造，特别是对于血管内皮细胞胞间连接的重塑起着至关重要作用。本研究利用细胞生物学、生物化学、分子生物学的方法，以及体外和体内细胞转移模型，揭示了乳腺癌细胞外泌体对癌细胞穿过血管内皮的作用及其分子机理。
乳腺癌细胞的分泌物是肿瘤微环境的重要组成部分。为了研究肿瘤微环境对肿瘤穿过血管内皮的影响，本文首先收集了乳腺癌细胞MDA-MB-231的培养上清，通过分离其上清及其富含外泌体组分和不含外泌体组分，利用体外细胞穿透实验发现细胞培养上清和富含外泌体组分能促进肿瘤细胞穿过血管内皮，其中富含外泌体组分的促进作用更加显著。本研究进一步提取了乳腺癌细胞的外泌体，发现用乳腺癌细胞外泌体处理血管内皮细胞后，血管内皮细胞胞间连接分子VE-cadherin和ZO-1的表达显著降低，成管能力减弱，提示乳腺癌细胞外泌体可能通过破坏血管内皮胞间完整性，进而促进肿瘤细胞穿过血管内皮。
究竟是外泌体中哪种或哪部分蛋白在此过程中起到关键作用？本研究通过获取外泌体蛋白质质谱数据，利用生物信息学方法的GeneOntology富集分析，发现在外泌体中含有多个与黏附和转移相关的蛋白质组分组。血小板反应蛋白-1(Thrombospondin-1, TSP1)是质谱检测出的可信度最高的蛋白质，且出现在四个得分较高的GO富集项中，与黏附、转移等生物学过程相关的候选分子中共有候选蛋白分子，提示TSP1可能是调节肿瘤细胞转移的关键蛋白。研究进一步发现，相对于非转移性乳腺癌细胞系MCF7，TSP1在高转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中高表达，并且TSP1在外泌体中表达显著高于细胞裂解液，提示TSP1可能促进乳腺癌转移。进一步验证实验表明，过表达TSP1蛋白的MCF7细胞，其外泌体中TSP1蛋白含量增加，并能显著促进肿瘤细胞穿过血管内皮；而沉默TSP1蛋白的MDA-MB-231细胞来源外泌体中TSP1含量减少，其促进肿瘤细胞穿过血管内皮的能力减弱。以上结果说明乳腺癌细胞来源的外泌体中TSP1是促进肿瘤细胞穿过血管内皮的关键蛋白。
乳腺癌外泌体中TSP1是如何促进肿瘤细胞穿过血管内皮？深入研究结果表明肿瘤细胞来源的外泌体TSP1作用于HUVECs胞间连接蛋白VE-cadherin和ZO-1，进而破坏血管内皮胞间连接完整性。过表达TSP1蛋白的肿瘤细胞外泌体显著抑制HUVECs的VE-cadherin和ZO-1的表达，而敲低THBS1基因的肿瘤细胞外泌体或利用TSP1抑制剂LSKL处理的肿瘤细胞外泌体反而提高了血管内皮细胞中这两种胞间连接蛋白的表达。以上结果表明乳腺癌外泌体TSP1下调血管内皮细胞胞间连接蛋白。
为了验证乳腺癌外泌体TSP1在体内能否降低血管内皮细胞连接完整性，进而促进乳腺癌穿透血管内皮发生迁移。本研究在斑马鱼模型中发现过表达TSP1的乳腺癌外泌体能够降低斑马鱼血管内皮连接分子VE-cadherin、ZO-1、CD146的表达，且过表达TSP1的乳腺癌细胞发生转移的数量显著高于低表达TSP1乳腺癌细胞组。证明了TSP1不仅能破坏斑马鱼血管内皮细胞胞间连接，同时增强乳腺癌细胞在斑马鱼体内迁移能力。显示TSP1过表达的外泌体处理斑马鱼后，乳腺癌细胞更容易发生转移。
综上，本论文揭示了肿瘤细胞来源的外泌体TSP1促进乳腺癌转移这一重要作用，明确了肿瘤细胞穿过血管发生转移的重要机制，为乳腺癌临床治疗的有效干预提供了新靶点。
乳腺癌细胞的分泌物是肿瘤微环境的重要组成部分。为了研究肿瘤微环境对肿瘤穿过血管内皮的影响，本文首先收集了乳腺癌细胞MDA-MB-231的培养上清，通过分离其上清及其富含外泌体组分和不含外泌体组分，利用体外细胞穿透实验发现细胞培养上清和富含外泌体组分能促进肿瘤细胞穿过血管内皮，其中富含外泌体组分的促进作用更加显著。本研究进一步提取了乳腺癌细胞的外泌体，发现用乳腺癌细胞外泌体处理血管内皮细胞后，血管内皮细胞胞间连接分子VE-cadherin和ZO-1的表达显著降低，成管能力减弱，提示乳腺癌细胞外泌体可能通过破坏血管内皮胞间完整性，进而促进肿瘤细胞穿过血管内皮。
究竟是外泌体中哪种或哪部分蛋白在此过程中起到关键作用？本研究通过获取外泌体蛋白质质谱数据，利用生物信息学方法的GeneOntology富集分析，发现在外泌体中含有多个与黏附和转移相关的蛋白质组分组。血小板反应蛋白-1(Thrombospondin-1, TSP1)是质谱检测出的可信度最高的蛋白质，且出现在四个得分较高的GO富集项中，与黏附、转移等生物学过程相关的候选分子中共有候选蛋白分子，提示TSP1可能是调节肿瘤细胞转移的关键蛋白。研究进一步发现，相对于非转移性乳腺癌细胞系MCF7，TSP1在高转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中高表达，并且TSP1在外泌体中表达显著高于细胞裂解液，提示TSP1可能促进乳腺癌转移。进一步验证实验表明，过表达TSP1蛋白的MCF7细胞，其外泌体中TSP1蛋白含量增加，并能显著促进肿瘤细胞穿过血管内皮；而沉默TSP1蛋白的MDA-MB-231细胞来源外泌体中TSP1含量减少，其促进肿瘤细胞穿过血管内皮的能力减弱。以上结果说明乳腺癌细胞来源的外泌体中TSP1是促进肿瘤细胞穿过血管内皮的关键蛋白。
乳腺癌外泌体中TSP1是如何促进肿瘤细胞穿过血管内皮？深入研究结果表明肿瘤细胞来源的外泌体TSP1作用于HUVECs胞间连接蛋白VE-cadherin和ZO-1，进而破坏血管内皮胞间连接完整性。过表达TSP1蛋白的肿瘤细胞外泌体显著抑制HUVECs的VE-cadherin和ZO-1的表达，而敲低THBS1基因的肿瘤细胞外泌体或利用TSP1抑制剂LSKL处理的肿瘤细胞外泌体反而提高了血管内皮细胞中这两种胞间连接蛋白的表达。以上结果表明乳腺癌外泌体TSP1下调血管内皮细胞胞间连接蛋白。
为了验证乳腺癌外泌体TSP1在体内能否降低血管内皮细胞连接完整性，进而促进乳腺癌穿透血管内皮发生迁移。本研究在斑马鱼模型中发现过表达TSP1的乳腺癌外泌体能够降低斑马鱼血管内皮连接分子VE-cadherin、ZO-1、CD146的表达，且过表达TSP1的乳腺癌细胞发生转移的数量显著高于低表达TSP1乳腺癌细胞组。证明了TSP1不仅能破坏斑马鱼血管内皮细胞胞间连接，同时增强乳腺癌细胞在斑马鱼体内迁移能力。显示TSP1过表达的外泌体处理斑马鱼后，乳腺癌细胞更容易发生转移。
综上，本论文揭示了肿瘤细胞来源的外泌体TSP1促进乳腺癌转移这一重要作用，明确了肿瘤细胞穿过血管发生转移的重要机制，为乳腺癌临床治疗的有效干预提供了新靶点。