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目的：长期以来，糖原一直被认为在能量代谢中起着关键作用。然而，我们最近的研究表明，由胞浆磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶Pck1介导的糖原代谢通过调节氧化还原状态来调控CD8+记忆T(Tmem)细胞的形成和维持。然而，对这一不寻常的代谢途径提出了一个问题，即Pck1在CD8+Tmem细胞中是如何上调的。在这里，我们将探讨Pck1在CD8+Tmem细胞中上调表达的具体机制。
方法：(1)体外分别用IL-2，IL-15将T细胞诱导为Teff和Tmem：取OT-I小鼠脾脏，制成单细悬液，将细胞种于6孔板中，细胞浓度为1×106/mL，用10ng/mL的SIINFEKLPeptide(OVA 257-264)刺激脾细胞，加入10ng/mL的IL-2培养3天，3天后，90%存活的细胞均为CD8+OT-IT细胞，将SIINFEKLPeptide洗掉，将活化的T细胞分别用IL-2和IL-15继续培养4天，IL-2培养的细胞即为Teff，IL-15培养的细胞即为Tmem。(2)为了确定CD8+Tmem细胞是否发生酮体的生成，我们首先将1×105个CD45.1+OT-IT细胞过继转移给C57BL/6(CD45.2+)小鼠，然后，再给小鼠尾静脉注射5×105集落形成单位(CFU)表达OVA蛋白的单核细胞增多性李斯特氏菌(Lm-OVA)来感染并激活T细胞。分别于感染后第6天和第30天，进行流式染色，并分选OVA特异性CD8+效应T细胞和Tmem细胞。通过液相色谱质谱(LC-MS)分析和荧光分析CD8+Tmem细胞中的AcAc和BHB水平。(3)为了验证在CD8+Tmem细胞中有着活跃的酮体代谢，q-PCR与WesternBlot检测酮体代谢相关酶Acat、Hmgcs2、Hmgcl、Bdh1的表达。(4)研究生酮代谢物是否影响以及如何影响CD8+Tmem细胞。体外实验：在培养基中加入了生理浓度的BHB(2-10 mM)或者AcAc分别处理CD8+Tmem。体内实验：将CD45.1+CD8+OT-IT细胞过继给C57BL/6小鼠，并在Lm-OVA感染后的第七天，开始给小鼠腹腔注射BHB和生理盐水。第30天时，将小鼠处死，分别取小鼠的眼球血、脾脏、淋巴结中的细胞进行一系列分析。(5)为了验证BHB影响CD8+T细胞的记忆发育，我们体外采用shRNA将OT-IT细胞中的Bdh1敲低，以阻断AcAc到BHB的转变。体内实验采用将转染shNC或shBdh1的CD8+OT-IT细胞过继给C57BL/6小鼠，并在Lm-OVA感染后的第七天，开始给小鼠腹腔注射BHB和生理盐水。第30天时，将小鼠处死，分别取小鼠的眼球血、脾脏、淋巴结、肝脏、肺脏、以及骨髓中的细胞进行一系列分析。(6)肿瘤免疫治疗模型：首先，将CD45.1+CD8+OT-IT细胞过继给C57BL/6小鼠，并在Lm-OVA感染后的第七天，开始给小鼠腹腔注射BHB和生理盐水。第30天时，给小鼠皮下接种OVA-B16，五天后，开始观察小鼠生存期以及记录肿瘤体积。(7)体外应用同位素示踪的方法，用13C-BHB处理CD8+Tn、Teff或Tmem细胞，用LC-MS(液质联用)检测分析TCA循环中间代谢产物(柠檬酸、延胡索酸、α-KG和苹果酸)13C的比例。(8)用Seahorse检测体外培养的CD8+Teff或Tmem细胞的耗氧率(OCR)。(9)探索BHB是如何调控Pck1的表达的。采用Westernblot和ChIP-qPCR分析BHB对CD8+Tmem细胞Pck1影响。
结果：(1)通过液相色谱质谱(LC-MS)分析和荧光定量分析，发现CD8+Tmem细胞中含有大量的AcAc和BHB相比于Tn细胞或Teff细胞。(2)通过q-PCR与WesternBlot检测分析发现，CD8+Tmem细胞中与酮体生成相关酶Acat、HMGCS2、Hmgcl、Bdh1表达上调相比于Tn和Teff细胞。(3)通过体外、体内实验发现，用BHB处理后，增加了CD8+Tmem细胞的数量，并且与记忆相关转录因子Tcf7、Lef1和Bcl6上调表达，说明生酮代谢产物BHB参与了CD8+T细胞的记忆发育。(4)通过qPCR和Westernblot检测分析发现，敲低Bdh1后的T细胞内的BHB含量减少，同时，抑制了Tmem细胞的形成，并且该现象可以通过提供BHB来补救。说明生酮代谢产物BHB在调节CD8+Tmem细胞形成方面具有重要作用。(5)通过观察小鼠生存期以及记录肿瘤大小发现，腹腔注射BHB组可增强OT-IT细胞介导的对OVA-B16黑色素瘤的破坏，并延长小鼠生存时间。相比之下，过继shBdh1OT-IT细胞的小鼠则显示出肿瘤生长不受抑制和生存期缩短，但是这可以通过注射BHB来缓解。(6)通过LC-MS分析发现，Tmem细胞中的13C-α-KG、13C-延胡索酸和13C-苹果酸的比值略高于Teff细胞，这表明BHB可作为Tmem细胞代谢的能量来源。(7)通过海马XF分析仪测量耗氧率(OCR)发现，BHB处理的CD8+Teff或Tmem细胞的耗氧率(OCR)没有改变相比于未处理组。并且，敲低Bdh1并不影响CD8+Tmem细胞的OCR，这说明BHB在CD8+Tmem细胞中的主要作用不包括其作为能量分子的功能。(8)通过Westernblot和ChIP-qPCR分析发现，BHB通过表观修饰FoxO1上的H3K9来上调Pck1的表达。
结论：CD8+Tmem细胞的线粒体中的乙酰辅酶A进入生酮代谢途径产生BHB，并利用BHB对FoxO1进行表观遗传修饰，导致FoxO1及其靶基因Pck1上调。
方法：(1)体外分别用IL-2，IL-15将T细胞诱导为Teff和Tmem：取OT-I小鼠脾脏，制成单细悬液，将细胞种于6孔板中，细胞浓度为1×106/mL，用10ng/mL的SIINFEKLPeptide(OVA 257-264)刺激脾细胞，加入10ng/mL的IL-2培养3天，3天后，90%存活的细胞均为CD8+OT-IT细胞，将SIINFEKLPeptide洗掉，将活化的T细胞分别用IL-2和IL-15继续培养4天，IL-2培养的细胞即为Teff，IL-15培养的细胞即为Tmem。(2)为了确定CD8+Tmem细胞是否发生酮体的生成，我们首先将1×105个CD45.1+OT-IT细胞过继转移给C57BL/6(CD45.2+)小鼠，然后，再给小鼠尾静脉注射5×105集落形成单位(CFU)表达OVA蛋白的单核细胞增多性李斯特氏菌(Lm-OVA)来感染并激活T细胞。分别于感染后第6天和第30天，进行流式染色，并分选OVA特异性CD8+效应T细胞和Tmem细胞。通过液相色谱质谱(LC-MS)分析和荧光分析CD8+Tmem细胞中的AcAc和BHB水平。(3)为了验证在CD8+Tmem细胞中有着活跃的酮体代谢，q-PCR与WesternBlot检测酮体代谢相关酶Acat、Hmgcs2、Hmgcl、Bdh1的表达。(4)研究生酮代谢物是否影响以及如何影响CD8+Tmem细胞。体外实验：在培养基中加入了生理浓度的BHB(2-10 mM)或者AcAc分别处理CD8+Tmem。体内实验：将CD45.1+CD8+OT-IT细胞过继给C57BL/6小鼠，并在Lm-OVA感染后的第七天，开始给小鼠腹腔注射BHB和生理盐水。第30天时，将小鼠处死，分别取小鼠的眼球血、脾脏、淋巴结中的细胞进行一系列分析。(5)为了验证BHB影响CD8+T细胞的记忆发育，我们体外采用shRNA将OT-IT细胞中的Bdh1敲低，以阻断AcAc到BHB的转变。体内实验采用将转染shNC或shBdh1的CD8+OT-IT细胞过继给C57BL/6小鼠，并在Lm-OVA感染后的第七天，开始给小鼠腹腔注射BHB和生理盐水。第30天时，将小鼠处死，分别取小鼠的眼球血、脾脏、淋巴结、肝脏、肺脏、以及骨髓中的细胞进行一系列分析。(6)肿瘤免疫治疗模型：首先，将CD45.1+CD8+OT-IT细胞过继给C57BL/6小鼠，并在Lm-OVA感染后的第七天，开始给小鼠腹腔注射BHB和生理盐水。第30天时，给小鼠皮下接种OVA-B16，五天后，开始观察小鼠生存期以及记录肿瘤体积。(7)体外应用同位素示踪的方法，用13C-BHB处理CD8+Tn、Teff或Tmem细胞，用LC-MS(液质联用)检测分析TCA循环中间代谢产物(柠檬酸、延胡索酸、α-KG和苹果酸)13C的比例。(8)用Seahorse检测体外培养的CD8+Teff或Tmem细胞的耗氧率(OCR)。(9)探索BHB是如何调控Pck1的表达的。采用Westernblot和ChIP-qPCR分析BHB对CD8+Tmem细胞Pck1影响。
结果：(1)通过液相色谱质谱(LC-MS)分析和荧光定量分析，发现CD8+Tmem细胞中含有大量的AcAc和BHB相比于Tn细胞或Teff细胞。(2)通过q-PCR与WesternBlot检测分析发现，CD8+Tmem细胞中与酮体生成相关酶Acat、HMGCS2、Hmgcl、Bdh1表达上调相比于Tn和Teff细胞。(3)通过体外、体内实验发现，用BHB处理后，增加了CD8+Tmem细胞的数量，并且与记忆相关转录因子Tcf7、Lef1和Bcl6上调表达，说明生酮代谢产物BHB参与了CD8+T细胞的记忆发育。(4)通过qPCR和Westernblot检测分析发现，敲低Bdh1后的T细胞内的BHB含量减少，同时，抑制了Tmem细胞的形成，并且该现象可以通过提供BHB来补救。说明生酮代谢产物BHB在调节CD8+Tmem细胞形成方面具有重要作用。(5)通过观察小鼠生存期以及记录肿瘤大小发现，腹腔注射BHB组可增强OT-IT细胞介导的对OVA-B16黑色素瘤的破坏，并延长小鼠生存时间。相比之下，过继shBdh1OT-IT细胞的小鼠则显示出肿瘤生长不受抑制和生存期缩短，但是这可以通过注射BHB来缓解。(6)通过LC-MS分析发现，Tmem细胞中的13C-α-KG、13C-延胡索酸和13C-苹果酸的比值略高于Teff细胞，这表明BHB可作为Tmem细胞代谢的能量来源。(7)通过海马XF分析仪测量耗氧率(OCR)发现，BHB处理的CD8+Teff或Tmem细胞的耗氧率(OCR)没有改变相比于未处理组。并且，敲低Bdh1并不影响CD8+Tmem细胞的OCR，这说明BHB在CD8+Tmem细胞中的主要作用不包括其作为能量分子的功能。(8)通过Westernblot和ChIP-qPCR分析发现，BHB通过表观修饰FoxO1上的H3K9来上调Pck1的表达。
结论：CD8+Tmem细胞的线粒体中的乙酰辅酶A进入生酮代谢途径产生BHB，并利用BHB对FoxO1进行表观遗传修饰，导致FoxO1及其靶基因Pck1上调。