非洲爪蟾IRBIT的克隆及IRBIT调控NBCe1机制的研究

• 作 者: 王萌
• 机 构: 华中科技大学
• 出 处: 华中科技大学
• 发表日期: 2020年期
• 关键词: 非洲爪蟾

IRBIT(IP3 receptor-binding protein released with inositol 1,4,5-trisphosphate)包括较短的IRBIT1和较长的IRBIT2，分别由AHCYL1和AHCYL2基因编码。IRBIT蛋白在机体内具有广泛的表达分布，与一系列功能迥异的蛋白存在相互作用，参与胞内Ca2+信号调控、酸碱平衡调控等，具有重要的生理学功能。生电性的Na+/HCO3?共转运体NBCe1由SLC4A4基因编码，参与维持机体酸碱平衡调控。IRBIT可以显著激活NBCe1-B(NBCe1的剪接异构体)的活性。然而，到目前为止，人们对IRBIT调控NBCe1-B的分子机制知之甚少。本研究在已有研究的基础上，从IRBIT的结构和细胞内相互作用的信号分子角度分析了IRBIT发挥功能的分子机制。
　　首先，在非洲爪蟾卵母细胞中克隆得到两种IRBIT的同源物，irbit2-L和irbit2-S，与已有的小鼠IRBIT同源物进行序列比对，得出IRBIT同源物之间在氨基端的可变性和羧基端的保守性。脊椎动物IRBIT同源物进化树分析表明IRBIT1直系同源物之间的同源性大于IRBIT2直系同源物之间的同源性。
　　双电极电压钳检测结果表明非洲爪蟾卵母细胞中克隆得到的irbit2-L和irbit2-S都能同鼠源IRBIT同源物一样激活NBCe1-B，免疫共沉淀实验结果证明在外源表达系统中irbit2-L和NBCe1-B相互作用。这些现象可以反映出NBCe1-B在卵母细胞中检测到的本底活性可能是由于非洲爪蟾IRBIT同源物的激活作用。通过对卵母细胞中内源IRBIT同源物结合NBCe1-B的干扰，检测到NBCe1-B的活性明显下降。
　　IRBIT同源物之间主要的差异在于氨基末端(Nt)附加结构域(appendage)。小鼠IRBIT同源物之间因Nt附加结构域的不同激活NBCe1-B的程度不同。对小鼠IRBIT1和IRBIT2的Nt附加结构域进行删除突变会降低其对NBCe1-B的刺激作用。前人研究显示，IRBIT1对NBCe1-B的激活作用依赖于IRBIT1第68位Ser(Ser68)的磷酸化。奇怪的是，我们发现，如果删除IRBIT1的Nt附加结构域，用Ala替换Ser68不影响IRBIT1对NBCe1-B的激活作用。我们的结果提示IRBIT的Nt附加结构域对IRBIT与NBCe1-B的相互作用具有重要的调节作用。
　　此外，我们发现Ca2+影响IRBIT与NBCe1-B的相互作用。用0Ca2+溶液处理卵母细胞，排空胞内的Ca2+，可显著降低IRBIT对NBCe1-B的激活效应。用CaMKII抑制剂KN93处理卵母细胞，对IRBIT与NBCe1-B的相互作用产生类似的抑制效应。我们推测Ca2+对IRBIT与NBCe1-B相互作用的影响可能是通过Ca2+下游CaMKII磷酸化的途径介导。
　　以上结果为进一步深入研究IRBIT激活NBCe1-B的分子机制打下基础。