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Waardenburg综合征(WS)是一种具有很强遗传性和临床异质性特点的综合征疾病，以感音神经性耳聋，头发、皮肤和虹膜色素沉着缺陷为主要特征。根据病人不同临床症状可分为WS1、WS2、WS3、WS4四种类型，目前导致WS发生的主要致病基因有PAX3、MITF、SNAI2、OX10、EDNRB和EDN3，其中PAX3突变是引起WS1型和WS2型的主要原因，在WS2型患者中发现MITF和SNAI2突变，而SOX10、EDNRB和EDN3突变可以导致WS2和WS4型疾病发生。
在本研究中收集并鉴定一个中国五代WS常染色体显性遗传家系，该家系的主要临床特征包括先天性耳聋、内眦外移、虹膜色素异常和头发色素沉着缺陷，被诊断为WS1型遗传病。首先选取距离PAX3物理图距大约1.07Mb的微卫星标记D2S126进行连锁分析，发现D2S126的多态与该家系患者紧密连锁,说明PAX3很可能是该家系的致病基因。随后对该家系先证者PAX3所有外显子和外显子与内含子交界处进行Sanger测序,发现该患者PAX3的第2号外显子上存在一个错义突变c.272A>C，该突变导致PAX3编码的蛋白第91位谷氨酰胺突变为脯氨酸即p.Gln91Pro,为新突变。该突变c.272A>C丧失BcnI限制性内切酶位点，利用限制性片段长度多态性(RFLP)分析发现该突变在家系内与疾病表型共分离，且200例正常人DNA对照样本均未发现该突变的存在。进一步生物信息学分析发现该突变有较高的致病性，对应的氨基酸残基谷氨酰胺从斑马鱼到人类高度保守。PAX3编码PAX3是一个转录因子，对PAX3蛋白结构分析发现，PAX3蛋白第91位谷氨酰胺位于其配对结构域(PD)的α螺旋3的C端，PAX3突变p.Gln91Pro将配对结构域中α螺旋3的C端转换成一个α螺旋3和α螺旋4之间的β转角的一部分，推测这种结构改变可能通过影响PAX3与DNA的结合能力从而影响其对下游靶基因的转录调控。为了探究PAX3突变是否影响其蛋白质功能，导致突变型PAX3致病的可能性，本研究分别构建了pcDNA3.1(+)-PAX3-WT-HA和pcDNA3.1(+)-PAX3-Mut-HA真核表达载体，但Westernblot检测和免疫荧光实验均未发现二者在表达和定位方面存在显著性差异。进一步通过双荧光素酶报告基因检测分析野生型与突变型PAX3对其下游靶基因MITF启动子的转录调控能力，结果发现与对照组相比野生型PAX3可有效提高MITF启动子转录活性约6.3倍，而突变型PAX3仅可轻微提高MITF启动子转录活性约1.4倍。该结果提示突变型PAX3降低MITF启动子转录活性可能是导致该家系致病原因。
综上所述，本研究在一个中国大的WS1常染色体显性家系中发现PAX3基因新突变c.272A>C(p.Gln91Pro)，进一步功能分析发现位于PAX3蛋白配对结构域的p.Gln91Pro突变改变了其α螺旋3的C端原有结构，以及突变型PAX3蛋白对其下游靶基因MITF启动子的转录激活能力显著降低，可能揭示了Waardenburg综合征1型的致病机制，这些发现为Waardenburg综合征致病机制的深入研究提供理论基础。
在本研究中收集并鉴定一个中国五代WS常染色体显性遗传家系，该家系的主要临床特征包括先天性耳聋、内眦外移、虹膜色素异常和头发色素沉着缺陷，被诊断为WS1型遗传病。首先选取距离PAX3物理图距大约1.07Mb的微卫星标记D2S126进行连锁分析，发现D2S126的多态与该家系患者紧密连锁,说明PAX3很可能是该家系的致病基因。随后对该家系先证者PAX3所有外显子和外显子与内含子交界处进行Sanger测序,发现该患者PAX3的第2号外显子上存在一个错义突变c.272A>C，该突变导致PAX3编码的蛋白第91位谷氨酰胺突变为脯氨酸即p.Gln91Pro,为新突变。该突变c.272A>C丧失BcnI限制性内切酶位点，利用限制性片段长度多态性(RFLP)分析发现该突变在家系内与疾病表型共分离，且200例正常人DNA对照样本均未发现该突变的存在。进一步生物信息学分析发现该突变有较高的致病性，对应的氨基酸残基谷氨酰胺从斑马鱼到人类高度保守。PAX3编码PAX3是一个转录因子，对PAX3蛋白结构分析发现，PAX3蛋白第91位谷氨酰胺位于其配对结构域(PD)的α螺旋3的C端，PAX3突变p.Gln91Pro将配对结构域中α螺旋3的C端转换成一个α螺旋3和α螺旋4之间的β转角的一部分，推测这种结构改变可能通过影响PAX3与DNA的结合能力从而影响其对下游靶基因的转录调控。为了探究PAX3突变是否影响其蛋白质功能，导致突变型PAX3致病的可能性，本研究分别构建了pcDNA3.1(+)-PAX3-WT-HA和pcDNA3.1(+)-PAX3-Mut-HA真核表达载体，但Westernblot检测和免疫荧光实验均未发现二者在表达和定位方面存在显著性差异。进一步通过双荧光素酶报告基因检测分析野生型与突变型PAX3对其下游靶基因MITF启动子的转录调控能力，结果发现与对照组相比野生型PAX3可有效提高MITF启动子转录活性约6.3倍，而突变型PAX3仅可轻微提高MITF启动子转录活性约1.4倍。该结果提示突变型PAX3降低MITF启动子转录活性可能是导致该家系致病原因。
综上所述，本研究在一个中国大的WS1常染色体显性家系中发现PAX3基因新突变c.272A>C(p.Gln91Pro)，进一步功能分析发现位于PAX3蛋白配对结构域的p.Gln91Pro突变改变了其α螺旋3的C端原有结构，以及突变型PAX3蛋白对其下游靶基因MITF启动子的转录激活能力显著降低，可能揭示了Waardenburg综合征1型的致病机制，这些发现为Waardenburg综合征致病机制的深入研究提供理论基础。