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生发泡阻滞(germinalvesiclearrest，GV阻滞)是一种卵母细胞成熟阻滞疾病，于1990年首次报道。该病患者的卵母细胞生发泡不能破裂，从而无法启动减数分裂，不能产生成熟的卵母细胞，最终导致女性不育。本论文研究了八个卵母细胞成熟阻滞家系，通过遗传学分析发现了两个家系的患者携带致病基因PATL2(ProteinassociatedwithtopoisomeraseⅡ)的新突变，进一步通过生化与分子生物学方法研究了这些突变致病的分子机制。
我们对八个家系的遗传学分析发现：家系1的先证者携带PATL2基因的纯合错义突变c.1376C>A，该突变导致第459位氨基酸由丝氨酸变成酪氨酸(p.S459Y)，患者的父亲母亲都携带该位点的杂合突变，表型正常；家系2的先证者携带PATL2基因的纯合错义突变c.1528C>A，导致该基因编码蛋白的第510位氨基酸由脯氨酸变成苏氨酸(p.P510T)，先证者妹妹也是患者，携带同样的纯合突变，而表型正常的父母是该位点的杂合突变携带者。PATL2蛋白氨基酸序列保守性分析结果显示这两个氨基酸位点在进化过程中都高度保守。生物信息学预测这两个点突变都是有害突变，S459Y突变导致了局部氢键数量减少和氢键位置的改变，可能影响蛋白稳定性，导致蛋白表达下降。为了明确这两个突变对蛋白表达的影响，我们构建了GFP标记的野生型和突变型人类PATL2基因表达载体，将其转染HEK293T细胞，48小时后提取细胞的总蛋白并通过Western检测PATL2蛋白的表达水平，结果表明与野生型相比，S459Y和P510T突变型PATL2蛋白的表达水平显著降低。蛋白定位结果表明突变对PATL2蛋白定位无影响。目前对人的PATL2基因突变导致GV阻滞的致病机制还不清楚，PATL2在爪蟾中的同源蛋白P100与CPEB等蛋白互作形成的复合体能够调控CCNB1的表达，CCNB1是调控生发泡破裂的MPF(Maturation promoting factors)组分之一，因此我们推测PATL2基因突变可能通过CCNB1蛋白影响生发泡破裂。为了理解PATL2基因突变致病的机制，我们研究了野生和突变型PATL2蛋白与CCNB1蛋白的互作。Co-IP结果表明S459Y和P510T突变蛋白仍能与CCNB1蛋白互作，但由于突变型PATL2蛋白的表达水平显著减低，这种表达水平的降低也可能影响到CCNB1蛋白的表达，从而影响MPF活性，最终影响生发泡破裂。
本研究通过对八个卵母细胞成熟阻滞家系的遗传学分析发现了PATL2基因的两个新的致病突变c.1376C>A(p.S459Y)和c.1528C>A(p.P510T)，通过生物信息学预测发现这两个突变可能影响蛋白的结构和功能，进一步通过体外表达实验确认了这两个突变降低了PATL2蛋白的表达水平，但突变对蛋白定位没有影响，突变的PATL2蛋白仍然可以与CCNB1蛋白互作，但由于突变型PATL2蛋白的表达水平是显著减低的，这种表达水平的降低可能影响到CCNB1蛋白的表达，从而影响MPF活性，最终影响生发泡破裂。本研究不仅丰富了PATL2基因突变谱，也为理解PALT2基因突变如何影响蛋白的功能提供了新的认识，为GV阻滞疾病的诊治提供了新的思路。
我们对八个家系的遗传学分析发现：家系1的先证者携带PATL2基因的纯合错义突变c.1376C>A，该突变导致第459位氨基酸由丝氨酸变成酪氨酸(p.S459Y)，患者的父亲母亲都携带该位点的杂合突变，表型正常；家系2的先证者携带PATL2基因的纯合错义突变c.1528C>A，导致该基因编码蛋白的第510位氨基酸由脯氨酸变成苏氨酸(p.P510T)，先证者妹妹也是患者，携带同样的纯合突变，而表型正常的父母是该位点的杂合突变携带者。PATL2蛋白氨基酸序列保守性分析结果显示这两个氨基酸位点在进化过程中都高度保守。生物信息学预测这两个点突变都是有害突变，S459Y突变导致了局部氢键数量减少和氢键位置的改变，可能影响蛋白稳定性，导致蛋白表达下降。为了明确这两个突变对蛋白表达的影响，我们构建了GFP标记的野生型和突变型人类PATL2基因表达载体，将其转染HEK293T细胞，48小时后提取细胞的总蛋白并通过Western检测PATL2蛋白的表达水平，结果表明与野生型相比，S459Y和P510T突变型PATL2蛋白的表达水平显著降低。蛋白定位结果表明突变对PATL2蛋白定位无影响。目前对人的PATL2基因突变导致GV阻滞的致病机制还不清楚，PATL2在爪蟾中的同源蛋白P100与CPEB等蛋白互作形成的复合体能够调控CCNB1的表达，CCNB1是调控生发泡破裂的MPF(Maturation promoting factors)组分之一，因此我们推测PATL2基因突变可能通过CCNB1蛋白影响生发泡破裂。为了理解PATL2基因突变致病的机制，我们研究了野生和突变型PATL2蛋白与CCNB1蛋白的互作。Co-IP结果表明S459Y和P510T突变蛋白仍能与CCNB1蛋白互作，但由于突变型PATL2蛋白的表达水平显著减低，这种表达水平的降低也可能影响到CCNB1蛋白的表达，从而影响MPF活性，最终影响生发泡破裂。
本研究通过对八个卵母细胞成熟阻滞家系的遗传学分析发现了PATL2基因的两个新的致病突变c.1376C>A(p.S459Y)和c.1528C>A(p.P510T)，通过生物信息学预测发现这两个突变可能影响蛋白的结构和功能，进一步通过体外表达实验确认了这两个突变降低了PATL2蛋白的表达水平，但突变对蛋白定位没有影响，突变的PATL2蛋白仍然可以与CCNB1蛋白互作，但由于突变型PATL2蛋白的表达水平是显著减低的，这种表达水平的降低可能影响到CCNB1蛋白的表达，从而影响MPF活性，最终影响生发泡破裂。本研究不仅丰富了PATL2基因突变谱，也为理解PALT2基因突变如何影响蛋白的功能提供了新的认识，为GV阻滞疾病的诊治提供了新的思路。