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目的：黑色素瘤多来源于皮肤真皮层黑色素细胞，因其高度恶性、高转移力导致死亡率高，严重危害人类健康，且常规的放化疗手段往往导致耐药和复发，肿瘤干细胞则被认为是其发生发展、侵袭转移以及复发的根源。大量研究证实代谢调控的改变对于肿瘤干细胞的长期存活及耐药都有着关键的作用。本课题组采用三维纤维蛋白软胶(3D fibrin gel)培养开发出筛选高致瘤性，能够自我更新的具有干细胞特性的肿瘤细胞，命名为肿瘤再生细胞(Tumor repopulating cells, TRCs)。本研究以人黑色素瘤TRCs为研究对象，以糖原代谢为出发点，通过体内外实验探究糖原代谢的改变对TRCs生长的影响及相关机制。本研究的完成有助于深入理解干细胞样黑色素瘤细胞的代谢特征，从新的角度揭示黑色素瘤的发生发展机制，为黑色素瘤的治疗提供新的思路。
方法：(1)常氧情况下，使用Real-timePCR检测A375、MP-1TRCs(3D培养，下称3D细胞)与分化完全的肿瘤细胞(2D培养，下称2D细胞)干性基因的表达情况。(2)常氧情况下，使用糖原检测试剂盒和过碘酸雪夫(Periodic Acid-Schiff stain, PAS)染色法分析A375、MP-13D和2D细胞糖原的含量。(3)常氧情况下，使用Real-timePCR和WesternBlot检测糖原代谢相关基因和蛋白的表达。(4)常氧或乏氧情况下，通过拍照统计克隆体积比较A375、MP-1TRCs的克隆生长差异。(5)常氧或乏氧情况下，使用糖原检测试剂盒和PAS染色法检测A375、MP-1TRCs中的糖原含量。(6)常氧或乏氧情况下，使用Real-timePCR和Westernblot检测A375、MP-1TRCs糖原相关酶mRNA和蛋白的表达变化。(7)常氧或乏氧情况下，A375、MP-1TRCs经糖原磷酸化酶抑制剂(Glycogen phosphorylase inhibitor, GPI )处理或沉默PYGL基因后通过液质联用(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS)检测G6P/G1P的含量。(8)常氧或乏氧情况下，A375、MP-1TRCs经不同浓度GPI处理后观察克隆生长的变化。(9)A375细胞敲除糖原磷酸化酶(Glycogen phosphorylase, PYGL)基因后通过3D软纤维蛋白基质胶培养TRCs比较常氧和乏氧情况下TRCs的克隆生长情况。(10)构建乏氧肿瘤模型，比较A375TRCs经糖原磷酸化酶抑制剂GPI处理后肿瘤体积大小变化。(11)构建乏氧肿瘤模型，A375细胞敲除PYGL基因后通过3D软纤维蛋白基质胶培养TRCs，经计数2×105的细胞接种到裸鼠皮下，比较实验组与对照组肿瘤生长大小的差异。(12)通过TCGA数据库分析肿瘤组织与癌旁组织糖原代谢相关基因的表达差异，葡萄糖磷酸变位酶(Phosphoglucomutase 1, PGM1)与黑色素瘤患者生存期的相关性。
结果：(1)常氧情况下，A375、MP-1细胞中3DTRCs比2D细胞的干性基因、糖原含量、糖原代谢相关基因和蛋白均表达升高。(2)与常氧情况下相比，A375、MP-1乏氧TRCs克隆生长更快、糖原含量更高、糖原相关基因和蛋白表达更高。(3)乏氧情况下，抑制A375、MP-1TRCs糖原分解，3DTRCs中G6P/G1P含量降低，而常氧情况下无显著差异。(4)经不同浓度GPI处理或敲除PYGL基因后乏氧TRCs克隆生长受到抑制。(5)体内实验经GPI处理或敲除PYGL基因后抑制了荷瘤小鼠肿瘤的生长。(6)生物信息学分析发现，肿瘤组织中糖原代谢相关基因比癌旁组织中表达高，PGM1与黑色素瘤患者生存期具有显著相关性，PGM1表达越高，生存期越短。
结论：常氧条件下相较于已分化的黑色素瘤细胞，人源黑色素瘤TRCs比2D细胞糖原代谢活跃。乏氧情况下TRCs比常氧状态下糖原循环流动加快，且在乏氧时TRCs生长比常氧情况下更加迅速，说明糖原代谢途径对黑色素瘤TRCs的生长发挥重要的作用，TRCs通过乏氧驱动糖原代谢促进自身增殖。在乏氧情况下，TRCs依赖糖原分解提供能量来促进生长，TRCs通过快速分解储备的糖原进而维持自身增殖。TCGA数据库生物信息学临床数据分析也佐证了糖原代谢旺盛在黑色素瘤进展中发挥了重要的作用。总之，在乏氧情况下，黑色素瘤TRCs糖原表达最高，TRCs在乏氧情况下能更好的利用糖原代谢提供能量。
方法：(1)常氧情况下，使用Real-timePCR检测A375、MP-1TRCs(3D培养，下称3D细胞)与分化完全的肿瘤细胞(2D培养，下称2D细胞)干性基因的表达情况。(2)常氧情况下，使用糖原检测试剂盒和过碘酸雪夫(Periodic Acid-Schiff stain, PAS)染色法分析A375、MP-13D和2D细胞糖原的含量。(3)常氧情况下，使用Real-timePCR和WesternBlot检测糖原代谢相关基因和蛋白的表达。(4)常氧或乏氧情况下，通过拍照统计克隆体积比较A375、MP-1TRCs的克隆生长差异。(5)常氧或乏氧情况下，使用糖原检测试剂盒和PAS染色法检测A375、MP-1TRCs中的糖原含量。(6)常氧或乏氧情况下，使用Real-timePCR和Westernblot检测A375、MP-1TRCs糖原相关酶mRNA和蛋白的表达变化。(7)常氧或乏氧情况下，A375、MP-1TRCs经糖原磷酸化酶抑制剂(Glycogen phosphorylase inhibitor, GPI )处理或沉默PYGL基因后通过液质联用(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS)检测G6P/G1P的含量。(8)常氧或乏氧情况下，A375、MP-1TRCs经不同浓度GPI处理后观察克隆生长的变化。(9)A375细胞敲除糖原磷酸化酶(Glycogen phosphorylase, PYGL)基因后通过3D软纤维蛋白基质胶培养TRCs比较常氧和乏氧情况下TRCs的克隆生长情况。(10)构建乏氧肿瘤模型，比较A375TRCs经糖原磷酸化酶抑制剂GPI处理后肿瘤体积大小变化。(11)构建乏氧肿瘤模型，A375细胞敲除PYGL基因后通过3D软纤维蛋白基质胶培养TRCs，经计数2×105的细胞接种到裸鼠皮下，比较实验组与对照组肿瘤生长大小的差异。(12)通过TCGA数据库分析肿瘤组织与癌旁组织糖原代谢相关基因的表达差异，葡萄糖磷酸变位酶(Phosphoglucomutase 1, PGM1)与黑色素瘤患者生存期的相关性。
结果：(1)常氧情况下，A375、MP-1细胞中3DTRCs比2D细胞的干性基因、糖原含量、糖原代谢相关基因和蛋白均表达升高。(2)与常氧情况下相比，A375、MP-1乏氧TRCs克隆生长更快、糖原含量更高、糖原相关基因和蛋白表达更高。(3)乏氧情况下，抑制A375、MP-1TRCs糖原分解，3DTRCs中G6P/G1P含量降低，而常氧情况下无显著差异。(4)经不同浓度GPI处理或敲除PYGL基因后乏氧TRCs克隆生长受到抑制。(5)体内实验经GPI处理或敲除PYGL基因后抑制了荷瘤小鼠肿瘤的生长。(6)生物信息学分析发现，肿瘤组织中糖原代谢相关基因比癌旁组织中表达高，PGM1与黑色素瘤患者生存期具有显著相关性，PGM1表达越高，生存期越短。
结论：常氧条件下相较于已分化的黑色素瘤细胞，人源黑色素瘤TRCs比2D细胞糖原代谢活跃。乏氧情况下TRCs比常氧状态下糖原循环流动加快，且在乏氧时TRCs生长比常氧情况下更加迅速，说明糖原代谢途径对黑色素瘤TRCs的生长发挥重要的作用，TRCs通过乏氧驱动糖原代谢促进自身增殖。在乏氧情况下，TRCs依赖糖原分解提供能量来促进生长，TRCs通过快速分解储备的糖原进而维持自身增殖。TCGA数据库生物信息学临床数据分析也佐证了糖原代谢旺盛在黑色素瘤进展中发挥了重要的作用。总之，在乏氧情况下，黑色素瘤TRCs糖原表达最高，TRCs在乏氧情况下能更好的利用糖原代谢提供能量。