【摘 要】
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兔肝球虫病是由斯氏艾美耳球虫寄生于兔肝胆管上皮细胞内引起的一种对兔养殖业危害极为严重的寄生性原虫病。该病在世界范围内广泛分布,多发于温热、潮湿的地方。兔在各发育阶段均可感染,以断奶后至11周龄的幼兔最易感,且症状最为明显,可严重影响兔生长发育,免疫力下降从而继发其他疾病,死亡率极高。针对这一问题,有效的预防、精准的诊断和及时的治疗是控制该疾病的重要手段。本研究在兔斯氏艾美耳球虫的转录数据中筛选出表
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兔肝球虫病是由斯氏艾美耳球虫寄生于兔肝胆管上皮细胞内引起的一种对兔养殖业危害极为严重的寄生性原虫病。该病在世界范围内广泛分布,多发于温热、潮湿的地方。兔在各发育阶段均可感染,以断奶后至11周龄的幼兔最易感,且症状最为明显,可严重影响兔生长发育,免疫力下降从而继发其他疾病,死亡率极高。针对这一问题,有效的预防、精准的诊断和及时的治疗是控制该疾病的重要手段。本研究在兔斯氏艾美耳球虫的转录数据中筛选出表面抗原（Surface antigen,SAG）基因中的Es.SAG4、Es.SAG5、Es.SAG7、Es.SAG8和Es.SAG11分别进行了基因扩增与原核表达,对上述5个表面抗原基因用相对荧光定量PCR（RT-PCR）的方法,在兔斯氏艾美耳球虫的4个不同生命周期阶段的转录水平进行了分析比较,同时使用免疫酶联吸附实验（ELISA）和免疫印迹（Western blot）两种方法,对重组表面抗原rEs.SAG4、rEs.SAG5、rEs.SAG7、rEs.SAG8和rEs.SAG11的血清学诊断价值作出了初步评估。此外,为今后快速精准的诊断肝球虫病提供了重要的数据参考。一、斯氏艾美耳球虫表面抗原基因SAG4、SAG5、SAG7、SAG8和SAG11的原核表达与特征分析表面抗原（Surface Antigens）是一类位于原虫细胞膜表面的分泌蛋白。这类蛋白在宿主细胞识别、入侵、黏附及免疫逃避等过程中发挥着重要的作用,不同的表面抗原分泌与原虫的不同生命阶段,每个表面抗原都在寄生虫中扮演重要的角色。本研究在兔斯氏艾美耳球虫的转录数据中筛选出表面抗原基因家族中的Es.SAG4、Es.SAG5、Es.SAG7、Es.SAG8和Es.SAG11,分别进行了基因扩增与原核表达,结果显示上述基因大小分别为444bp、444bp、531bp、663bp和765bp,对应基因编码147、147、176、220和254个氨基酸。通过软件预测rEs SAG4、rEs.SAG5、rEs.SAG7、rEs.SAG8和rEs.SAG11的蛋白质分子量分别约为15.3k Da、16.18k Da、19.85k Da、23.63k Da和27.3k Da,生物信息学分析软件预测,Es.SAG8和Es.SAG11存在信号肽位点,而Es.SAG4、Es.SAG5、Es.SAG7不存在信号肽位点;Es.SAG4存在1个跨膜结构域;Es.SAG5、Es.SAG7和Es.SAG11均拥有1个N-糖基化位点。使用RT-PCR对这5个基因在兔斯氏艾美耳球虫4个不同生命周期阶段的转录水平进行比较,发现Es.SAG4、Es.SAG7、Es.SAG8和Es.SAG11在斯氏艾美耳球虫裂殖子阶段的转录水平较高,而Es.SAG5在斯氏艾美耳球虫孢子化阶段有较高的转录。二、斯氏艾美耳球虫表面抗原rEs.SAG4、rEs.SAG5、rEs.SAG7、rEs.SAG8和rEs.SAG11的诊断价值评估兔斯氏艾美耳球虫阳性血清做免疫印迹,发现这5个重组蛋白均能被识别。基于其良好的免疫反应性,用建立的间接酶联免疫吸附试验方法（ELISA）以重组Es.SAG4（rEs SAG4）、rEs.SAG5、rEs.SAG7、rEs.SAG8和rEs.SAG11为抗原,敏感性分别为97.92%、87.5%、91.67%、93.75%和97.92%,特异性为100%、95.83%、97.92%、100%和85.42%,利用3份兔肠球虫阳性血清和3份兔疥螨阳性血清分别做免疫印迹,发现rEs.SAG5、rEs.SAG7和rEs.SAG11与兔肠球虫阳性血清有强烈的交叉反应,但与兔疥螨阳性血清无交叉反应,rEs.SAG4和rEs.SAG8与兔肠球虫和兔疥螨均无交叉反应。通过以上实验表明,重组蛋白rEs.SAG4、rEs.SAG5、rEs.SAG7、rEs.SAG8和rEs.SAG11均可作为兔球虫病诊断抗原,其中rEs.SAG4有较高的敏感性和特异性,可作为候选诊断抗原。
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