STIM1对猪肠上皮细胞损伤修复的影响及多胺和色氨酸的调控研究

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肠粘膜屏障受到破坏后,会触发机体肠上皮修复机制(快速修复和后续修复)来保护肠道屏障。快速修复过程主要依赖细胞迁移,后续修复则主要通过关闭细胞间隙来维持紧密连接的完整性。基质相互作用分子1(STIM1)在猪肠上皮细胞损伤修复作用国内外未见报道。同时,多胺和色氨酸是否通过STIM1信号介导修复猪肠上皮细胞损伤,国内外未见报道。本试验以猪IPEC-J2细胞为模型,研究STIM1对猪肠上皮细胞迁移和肠上皮屏障功能的影响、可能机制以及是否受多胺和色氨酸的调控。试验一:STIM1在猪肠上皮细胞迁移的作用及多胺和色氨酸的调控研究本试验使用划痕损伤方法,探讨了STIM1对IPEC-J2细胞迁移的影响。结果如下:(1)干扰STIM1抑制了细胞迁移、降低了STIM1和瞬时受体电位通道1(TRPC1)的蛋白浓度和三磷酸肌醇(IP3)的含量,而过表达STIM1则得到了相反的结果。这些结果揭示,上调STIM1促进猪肠上皮细胞迁移。(2)1μM SKF96365(TRPC1抑制剂)抑制了细胞迁移、降低了STIM1和TRPC1蛋白浓度和IP3的含量,表明:下调TRPC1减少猪肠上皮细胞迁移。(3)过表达野生型和突变型STIM1能促进细胞迁移、增加了STIM1和TRPC1蛋白浓度和IP3的含量。进一步采用1μM SKF96365处理后,过表达野生型和突变型STIM1对IPEC-J2细胞迁移、STIM1和TRPC1蛋白浓度和IP3含量的促进效果被抑制,表明:过表达STIM1上调TRPC1信号提高猪肠上皮细胞迁移。(4)5m M二氟甲基鸟氨酸(DFMO)能显著抑制了IPEC-J2细胞迁移、降低了STIM1和TRPC1蛋白浓度和IP3含量。腐胺的添加缓解了DFMO对IPEC-J2细胞迁移、STIM1和TRPC1蛋白浓度和IP3含量的抑制作用,表明:多胺缺乏减少STIM1/TRPC1复合物水平,降低了猪肠上皮细胞迁移。(5)与DFMO组相比,DFMO+过表达野生型和突变型STIM1会缓解DFMO对细胞迁移、STIM1和TRPC1蛋白浓度和IP3的含量的抑制作用,表明:多胺缺乏,进一步上调STIM1表达能提高STIM1/TRPC1复合物水平,促进细胞迁移。(6)外源腐胺或色氨酸的添加会促进IPEC-J2细胞迁移、提高STIM1和TRPC1蛋白浓度和IP3含量。干扰STIM1后,腐胺或色氨酸对IPEC-J2细胞迁移、STIM1和TRPC1蛋白浓度和IP3的含量的促进效果得到显著的抑制,表明:外源多胺或色氨酸能通过STIM1/TRPC1信号通路介导提高猪肠上皮细胞迁移。试验二:STIM1在猪肠上皮屏障功能的作用及多胺和色氨酸的调控研究本试验构建过氧化氢(H2O2)氧化损伤模型,探讨了STIM1对IPEC-J2肠上皮屏障功能的影响。结果如下:(1)与对照组相比,600μM H2O2降低IPEC-J2细胞中STIM1、TRPC1、occludin、claudin-1和闭锁小带蛋白1(ZO-1)的浓度,减少跨上皮电阻(TER)以及增加异硫氰酸荧光素蔔聚糖4k Da(FD4)的通透性(P<0.05)。与H2O2相比,H2O2+干扰STIM1会显著降低IPEC-J2细胞中STIM1、TRPC1、occludin、ZO-1和claudin-1蛋白浓度,减少TER以及增加FD4的通透性(P<0.05),而H2O2+过表达STIM1得到相反的结果,表明:上调STIM1增加紧密连接蛋白水平和TER值以及减少FD4的通透性,进而来提高细胞屏障功能。(2)过表达野生型STIM1能显著增加H2O2处理的细胞中occludin、ZO-1、claudin-1、STIM1和TRPC1蛋白浓度,增加TER以及减少FD4的通透性(P<0.05),再此基础上抑制TRPC1信号后,其上述指标结果完全相反,表明:过表达STIM1上调TRPC1信号来提高IPEC-J2细胞的紧密连接的蛋白浓度,增加TER值以及减少FD4的通透性。(3)与H2O2组相比,75μM腐胺+H2O2组提高了occludin、ZO-1、claudin-1、STIM1和TRPC1的蛋白浓度,增加了TER和IP3含量以及降低了FD4的通透性(P<0.05);与腐胺组相比,腐胺+STIM1-si RNA组降低了occludin、ZO-1、claudin-1、STIM1和TRPC1的蛋白浓度,降低了TER和IP3含量以及提高了FD4的通透性(P<0.05),表明:腐胺能通过STIM1/TRPC1信号通路介导促进细胞紧密连接的完整性以及减少肠上皮的通透性。(4)与H2O2组相比,700μM色氨酸+H2O2组显著增加细胞occludin、ZO-1、claudin-1、STIM1和TRPC1的蛋白浓度,增加了TER和IP3含量以及降低了FD4的通透性(P<0.05);与色氨酸组相比,色氨酸+STIM1-si RNA组显著降低IPEC-J2细胞内occludin、ZO-1、claudin-1、STIM1和TRPC1的蛋白浓度,降低了TER和IP3含量以及提高了FD4的通透性(P<0.05),表明:色氨酸能通过STIM1/TRPC1信号通路介导促进猪肠上皮细胞紧密连接的完整性以及减少肠上皮的通透性。综上,过表达STIM1上调TRPC1信号提高细胞迁移和紧密连接蛋白水平、减少肠上皮的通透性来促进猪肠上皮细胞损伤修复。多胺和色氨酸提高猪肠上皮细胞迁移和肠上皮屏障功能,提高了猪肠上皮损伤修复,STIM1/TRPC1信号通路参与多胺和色氨酸的损伤修复。
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