【摘 要】
：
羧肽酶A（EC 3.4.16）是一类水解蛋白和多肽底物C端芳香族氨基酸或脂肪族氨基酸残基的消化酶,其添加能改善幼龄动物因消化酶分泌不足而引起的消化问题,因此在养殖业中具有较高的应用价值。然而目前商品羧肽酶A主要由猪胰腺提取、纯化而来,因此要在动物饲料中经济地应用这种酶还面临着相当大的挑战。通过分子生物学方法克隆猪胰腺羧肽酶A1酶原（proCPA1）基因,构建高效表达载体表达proCPA1并且分离纯
论文部分内容阅读
羧肽酶A（EC 3.4.16）是一类水解蛋白和多肽底物C端芳香族氨基酸或脂肪族氨基酸残基的消化酶,其添加能改善幼龄动物因消化酶分泌不足而引起的消化问题,因此在养殖业中具有较高的应用价值。然而目前商品羧肽酶A主要由猪胰腺提取、纯化而来,因此要在动物饲料中经济地应用这种酶还面临着相当大的挑战。通过分子生物学方法克隆猪胰腺羧肽酶A1酶原（proCPA1）基因,构建高效表达载体表达proCPA1并且分离纯化目标蛋白,利用基因工程手段大量制备CPA1蛋白具有重要的研究意义和广阔的市场前景。 毕赤酵母表达系统具有易于高密度发酵、表达基因稳定整合于宿主基因组、表达产物能有效分泌并适当糖基化、培养方便经济等特点,经过近十年发展,已成为较完善的外源基因表达系统。在此我们克隆了猪胰腺proCPA1基因并构建了proCPA1的毕赤酵母表达系统,通过甲醇诱导成功表达获得proCPA1蛋白,为下一步大量制备CPA1蛋白提供基础,研究结果如下: 以猪新鲜胰腺为实验材料,用TRIzol法提取胰腺总RNA,采用RT-PCR技术扩增出proCPA1基因的cDNA序列,将其克隆到pMD18-T载体,经测序分析克隆的基因与猪胰腺羧肽酶A1酶原基因序列一致;将proCPA1基因定向克隆到表达载体pPICZαA上,构建了重组表达质粒pPICZαA-proCPA1;重组质粒经PmeⅠ酶线性化后电穿孔法转化毕赤酵母X-33细胞;采用实时荧光定量RT-PCR筛选高RNA表达的阳性转化子用于进一步重组蛋白诱导表达;筛选的阳性转化子于BMGY摇瓶培养后于BMMY用甲醇进行诱导,表达产物经His-Tag Ni亲和层析纯化,得到纯化的蛋白,经SDS-PAGE,考马斯亮蓝染色分析显示纯化蛋白分子量约为47kDa,与目标蛋白预期分子量大小一致;进一步经肽质量指纹图谱（PMF）以及Western blot分析证实,表达、纯化的蛋白就是重组猪胰腺羧肽酶A1酶原蛋白。 本研究采用毕赤酵母表达系统成功表达了重组猪胰腺proCPA1,为下一步优化诱导表达条件,大量生产应用该蛋白奠定了基础。
其他文献
随着我国“交通强国”战略实施和经济快速发展,基于通信的列车运行控制系统（Communication Based Train Control,CBTC）已基本取代了基于轨道电路或有源应答器的列控系统,成为了城市轨道交通列车自动控制系统（Automatic Train Control,ATC）的主要制式。在此背景下,本文设计并实现了基于B/S架构的CBTC设备仿真系统,该系统可在ATS室内测试、CBT
本文以矮拉山公路隧道为依托工程,采用现场调研、理论分析、回归分析、数值分析及现场试验等研究手段,对矮拉山公路隧道凝灰岩段大变形影响因素、破坏机理、变形控制技术展开了深入系统的研究,主要研究内容及成果如下:（1）通过施工现场大变形破坏情况调研、监控数据分析以及理论分析,得出凝灰岩大变形段破坏特征主要有:变形量大、变形速率快、变形持续时间长、变形具有集中优势部位、大变形多具有挤压大变形变而不塌的特点等
近些年来,我国的城市轨道交通行业实现了蓬勃发展,其中维修是保障地铁车辆安全高效运行的重要服务之一。由于目前地铁车辆定制设计核心主要聚焦于产品功能和性能的满足,产品设计与维修服务设计尚未形成良好的协同和集成机制,产生了高昂的维修成本。在设计阶段可以很大程度上决定产品的全生命周期成本,这也为主机厂带来了更多的发展机遇,主机厂负责地铁产品的全生命周期维修服务后,有利于降低维修成本,创造新的利润增长点。转
贫富差距悬殊是我国比较突出的社会问题,财富的“马太效应”长期存在。对此,国家采取一系列宏观政策调控措施,制造平等机会、营造公平市场,很大程度阻止了贫富差距的进一步扩大。金融扶贫作为扶贫攻坚战的重要扶贫方式,已帮助大量贫困户脱贫摘帽。事实上,要消除相对贫困和防止返贫现象,需要穷人自身的努力,而不是只指望政府和慈善机构的救济。贫穷的本质在于穷人和富人自身的选择,当穷人选择了安于现状,富人选择了以财生财
随着轨道交通技术的深入研究和区域经济的快速发展,城际铁路以其经济舒适、安全便捷、节能环保等优势在轨道交通网络中扮演着重要的角色。与此同时,一带一路战略构想的提出进一步带动了亚太地区铁路交通建设的发展。伴随着国际铁路贸易的蓬勃发展,为了满足不同的运营需求,中国轨道交通车辆装备技术不断更新发展,结构形式越来越多样化。铰接式车辆以其整车重量低、被动安全性能好、曲线通过性能优良、国外应用技术成熟等优点,广
关节软骨疾病是一种常见的临床疾病。由于天然软骨是无血管组织,导致其再生能力十分有限,而目前的治疗方案尚无法提供一个完全彻底的解决方法。水凝胶因为具有和天然软骨相似的三维结构,因此将其和外加刺激结合起来运用于组织工程的方法在骨软骨修复中得到了良好表现。但是借助外场刺激的方法有一定的实施难度,限制了它们的应用,那些具有自发刺激细胞活性的水凝胶因此受到了广泛关注。鉴于软骨组织中的胶原蛋白具有压电效应,本
中国高速铁路即将迈入时速400公里时代,如此高的速度,在世界范围内并无现成经验可以借鉴,其背后蕴含着巨大机遇和挑战。现役高铁的运行实践表明,在服役过程中,轮轨接触表面可能会出现各种短波激励,恶化轮轨滚动接触行为,显著降低轮轨运行品质,甚至威胁列车安全。考虑到短波激励在更高速铁路上可能依旧高发,有必要对短波激励下更高速轮轨间瞬态滚动接触行为开展深入研究,为设计更高速铁路奠定坚实的理论基础。鉴于此,本
大苞景天（Sedum amplibracteatum）的带根全草药食兼用,也可观赏。然而种子繁殖极困难,植物自然资源匮乏,高山引种低海拔地区驯化栽培时病虫害发生严重。本文首先介绍了国内外对该属植物繁殖和化学成分的研究现状。试验以野生大苞景天为试验材料,通过单因子试验和正交试验,研究了不同营养条件对愈伤组织诱导、愈伤组织分化、芽生根的影响效应,获得了再生苗,旨在利用生物技术生产种苗,并为生物活性成分
桥梁转体施工是将桥梁结构部分或整体在便于施工的非成桥位置处建造后通过绕墩柱或拱座等一固定点旋转至成桥位置的一种施工方法。目前常见的旋转方法主要有:竖向旋转、水平面内的旋转和二者相结合旋转。转体施工能够有效提升施工效率并避免对桥下既有交通线路或建筑物的影响。但在转体施工过程中,对转体辅助设施、转体控制等技术要求较高。本文依托张唐铁路64m+64m T构桥的施工开展转体施工分析研究,主要工作及结论如下
糖尿病皮肤伤口处的持续性炎症反应导致过量的活性氧产生,使得糖尿病皮肤伤口处于长期炎症的恶性循环,伤口愈合缓慢,甚至无法愈合。因此,有必要开发一种具有抗氧化、抗炎等生物活性的多功能伤口水凝胶敷料,以促进糖尿病皮肤伤口修复。水凝胶敷料是近年来颇受关注的一种新型创伤敷料,而由于糖尿病人的皮肤比较脆弱,因此设计粘附性且柔软的水凝胶敷料是非常关键的的。为了满足用于慢性糖尿病皮肤伤口治疗的水凝胶敷料的所需特性