论文部分内容阅读
鸭源鹅细小病毒（Duck-origin goose parvovirus,D-GPV）属于细小病毒亚科（Parvovirinae）,细小病毒属（Parvovirinaes）成员,其基因组为单股DNA。D-GPV感染樱桃谷肉鸭引起发育不良、舌头外伸、生长迟缓为主要特征的流行性疾病,根据临床症状初步命名为鸭喙萎缩侏儒症综合征（beak atrophy and dwarfism syndrome,BADS）。自2015年报道以来,D-GPV给中国樱桃谷肉鸭养殖企业造成了巨大的经济损失。因此,系统研究D-GPV在鸭体内的侵染规律,制备高效价的疫苗成为当务之急。本研究以临床分离到的一株D-GPV人工感染樱桃谷鸭,探究D-GPV在樱桃谷鸭体内的动态分布,并免疫产蛋母鸡制备卵黄抗体,以期为临床治疗该病提供一定的理论与应用基础。主要研究结果如下:1.D-GPV的分离鉴定及VP1基因分析将过滤除菌的病毒液经尿囊腔途径接种9日龄樱桃谷鸭胚,盲传5代。提取病毒DNA,采用PCR扩增VP1基因,回收片段与T载体连接,并转化至自备的DH5α感受态细胞中,摇菌培养,经过菌液PCR鉴定为阳性克隆子后,进行测序及分析。另用尿囊液做9个连续10倍梯度稀释,计算ELD50。同时进行动物回归实验。结果表明,死亡鸭胚胚体水肿、全身散在性出血,部分鸭喙发育不全,畸形,弯折。VP1序列分析显示,VP1基因大小约为2203bp,共编码734个氨基酸残基,与水禽细小病毒的VP1基因编码的氨基酸同源性在85.4%-99.5%之间。ELD50为10-6.54/0.2m L。动物回归实验结果显示,14d后感染组生长较对照组缓慢,喙长较对照组短,感染组胫骨稍肿胀。通过分离鉴定、动物回归实验,确定该病毒为一株D-GPV,命名为QH-L01株。2.D-GPV在体内的动态分布研究和组织病理学研究将尿囊液按肌肉注射方式分组对无疫原2日龄樱桃谷肉鸭进行接种,剂量为106.54ELD500.2m L。在0.5h,1h,2h,4h,8h,12h,24h,48h,72h,144h,216h时间点解剖樱桃谷肉鸭,取各脏器、组织和血液,提取组织及血液病毒DNA,-80℃保存及中性甲醛固定。用VP1序列建立荧光定量标准曲线。将提取的D-GPV核酸通过荧光定量测定定量拷贝数。将多聚甲醛固定的组织进行石蜡切片及HE染色,进行病理观察。结果显示,建立荧光定量标准曲线为Ct=-3.326×lg[virus copies]+38.902（R~2=0.997）。荧光定量结果显示在接种D-GPV后1h,仅在脾和血液中中检测到D-GPV,拷贝数分别为102.86copies/g和102.62copies/m L。至接种后8h,所有组织中均检测到D-GPV。此后,在12h,24h,48h,72h-216h,分别在肺、盲肠、回肠、十二指肠组织中检测到病毒含量最大,分别为108.28copies/g,109.23copies/g,107.1copies/g,109.83copies/g。病理组织切片显示,12h肺萎缩,肺小叶数量显著减少;48h脑膜下炎性细胞浸润;48h盲肠和回肠局部黏膜顶端坏死、脱落,淋巴细胞增多;72h十二指肠绒毛上皮细胞坏死脱落等病理变化。可见脑、肺、盲肠、回肠、十二指肠是D-GPV的主要靶器官,且病毒主要浸染途径为病毒在感染位点（肌肉）通过血液循环,到达初始感染点（脾）,通过血液循环先到肺大量增殖,再到盲肠,回肠,十二指肠等组织增殖,进而到达全身。3.抗D-GPV卵黄抗体的制备将尿囊液用0.2%的甲醛灭活,与FCA和FIA按1:1混合,灭活疫苗A、灭活苗B。10只SPF产蛋鸡分为两组,实验组鸡腿部肌肉注射灭活疫苗A,1m L/只,间隔7天;二次免疫同为腿部肌肉注射灭活疫苗B,1m L/只,间隔7天。第3次同为腿部肌肉注射灭活疫苗免疫B,1m L/只。收集免疫后鸡蛋,水提取法提取Ig Y,采用琼脂扩散方法进行效价测定,SDS-PAGE电泳测定抗体纯度,将提纯的Ig Y进行动物保护实验。结果显示:最佳水提取卵黄抗体条件为p H 5.2和水稀释度1:8,3免后的D-GPV卵黄抗体效价为1:16,经过二次硫酸铵纯化Ig Y,纯度为87.9%,SDS-PAGE结果显示Ig Y在67k Da和38k Da处出现明显条带,分别为Ig Y的重链和轻链。动物保护实验结果显示,Ig Y能有效保护接种D-GPV的樱桃谷肉鸭;9日龄治疗鸭体重较感染组增加,且差异极显著;病理组织学观测显示,主要的损伤靶器官结构上有所恢复。综上所述,本研究利用从临床分离到的一株D-GPV,发现了D-GPV在樱桃谷肉鸭体内从肌肉到肺再到盲肠和十二指肠的动态分布变化,及对樱桃谷肉鸭主要损伤靶器官为肺、盲肠、十二指肠、回肠等器官,并制备了对D-GPV引起的BADS有治疗保护效果的Ig Y,补充了D-GPV的基础研究,为临床预防治疗D-GPV提供了有效技术。