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缺血性脑中风是一种由血栓栓塞性动脉闭塞引起的神经系统疾病，具有发病迅速、病情复杂、致死致残率高等特点，近年已成为我国居民死亡的重要原因。目前临床上针对缺血性脑中风的治疗措施仍以药物和手术溶栓为主，这些治疗手段虽然能在一定程度上挽救濒临死亡的脑细胞，同时也会使缺血组织的病理损害进一步加重，出现脑缺血再灌注损伤。因此，研究脑缺血再灌注损伤的病理生理学机制，探究具有神经保护作用的药物靶点，具有重要的意义。
二酰甘油激酶(Diacylglycerol kinase，DGKs)是体内肌醇磷脂信号系统的重要调节因子，目前已发现多个家庭成员，其中二酰甘油激酶E(DGKE)是DGKs家族Ⅲ亚类中唯一的成员，具有独特的结构和生物学功能。新近临床研究发现，二酰甘油激酶E的功能缺失性突变是导致非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)的一个新的病理生理机制，我们的前期研究也发现DGKE在肾缺血再灌注引起的急性肾损伤中发挥保护作用，但二酰甘油激酶E是否参与缺血性脑损伤目前未见报道。
研究目的
本课题采用大脑中动脉栓塞法(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)建立小鼠实验性脑缺血再灌注损伤模型，并通过细胞糖氧剥夺法(Oxygen-glucosedeprivation，OGD)模拟体外缺氧环境，利用模式动物和RNA干扰等技术，借助于形态学、分子生物学、流式细胞术等方法，探究二酰甘油激酶E在体内外脑缺血再灌注损伤模型中的表达变化和作用，并初步探讨其发挥作用的分子生物学机制。
实验方法与结果
1.二酰甘油激酶E在小鼠各组织中的表达模式
分别使用PCR、蛋白免疫印迹法(Western blot，WB)检测二酰甘油激酶E在小鼠各组织中mRNA和蛋白表达水平，结果显示，二酰甘油激酶E在小鼠脑组织中存在表达。
2.二酰甘油激酶E在实验性脑缺血再灌注损伤后脑皮层的表达
选取鼠龄8-12w，体重为23±2g的野生型C57BL/6J小鼠，实验室条件下适应性饲养一周后随机分为假手术组(Sham)和脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI)模型组。通过大脑中动脉栓线阻断法构建小鼠实验性脑缺血模型，缺血两小时后实现再灌注。通过神经病学评分、脑梗死面积计算、形态学染色及TUNEL染色等方法，确定模型制备成功。
通过实时定量RT-PCR、蛋白免疫印迹法、免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)等方法，对小鼠脑皮层中的二酰甘油激酶E在不同分组小鼠脑皮层中的mRNA和蛋白表达水平进行检测，结果显示，与假手术组相比，脑缺血再灌注损伤后，缺血侧脑组织皮层中DGKE的表达显著降低。进一步通过免疫荧光(Immunofluorescence，IF)双标法确定二酰甘油激酶E的细胞定位。
3.二酰甘油激酶E在实验性脑缺血再灌注损伤中的作用
选用符合实验条件的二酰甘油激酶E基因过表达(Dgkeoverexpression，Rosa26-Dgke+/+)小鼠和野生型(Wide Type，WT)小鼠，分别构建实验性脑缺血再灌注损伤模型。
通过神经病学评分、脑梗死面积计算、HE染色、尼氏染色及TUNEL染色等方法发现，与野生组动物相比，过表达二酰甘油激酶E可显著改善脑缺血再灌注造成的神经行为学缺陷，缩小脑梗死面积，减轻缺血侧脑皮层的病理改变，增加存活的神经元数量，并减少缺血半暗带的凋亡细胞数。
分别使用脑星形胶质细胞和小胶质细胞的标志物GFAP和Iba-1对脑组织切片进行免疫荧光染色，结果显示，与假手术组相比，野生组小鼠在缺血再灌注后脑组织皮层半暗带中出现大量激活的星形胶质细胞和小胶质细胞，而过表达DGKE可显著降低脑缺血再灌注后星形胶质细胞和小胶质细胞的激活现象。
以上结果表明，过表达二酰甘油激酶E对实验性脑缺血再灌注损伤发挥保护作用。
4.过表达二酰甘油激酶E减轻缺血再灌注损伤后脑组织的炎症应答反应
分别使用实时定量RT-PCR和免疫荧光染色法检测脑组织中致炎细胞因子表达水平和炎性细胞浸润情况，结果显示，过表达DGKE可显著降低由缺血再灌注损伤引起的致炎细胞因子过度表达，并减少中性粒细胞和巨噬细胞的浸润，说明DGKE的神经保护作用可能与其减轻炎症反应有关。
5.二酰甘油激酶E在脑缺血再灌注损伤中的神经保护作用机制与抑制PKC通路有关
使用Westernblot法检测脑缺血再灌注损伤后脑皮层半暗带的PKC磷酸化水平，结果显示，与假手术组相比，缺血再灌注后野生组小鼠脑组织皮层半暗带中PKC的磷酸化水平显著升高，说明其被明显激活，而过表达DGKE可显著降低缺血脑组织中PKC的激活程度，初步说明DGKE的神经保护作用机制与抑制PKC通路有关。
体外实验也得到相似的结果。
结论与创新性
结论:脑缺血再灌注损伤后脑组织皮层中二酰甘油激酶E的表达降低，过表达DGKE后对实验性脑缺血再灌注损伤后发挥保护作用，该作用可能与抑制DAG-PKC通路、减轻缺血侧脑组织的炎症反应等机制有关。
创新性:本研究首次使用模式动物，通过体内外实验性脑缺血再灌注组损伤模型，明确了二酰甘油激酶E在缺血性脑损伤中的保护作用。本研究将为扩展二酰甘油激酶E的生物学功能、完善脑缺血再灌注损伤的病理生理学机制提供研究基础，并为临床开发针对缺血性脑血管病的有效干预策略提供启示。
二酰甘油激酶(Diacylglycerol kinase，DGKs)是体内肌醇磷脂信号系统的重要调节因子，目前已发现多个家庭成员，其中二酰甘油激酶E(DGKE)是DGKs家族Ⅲ亚类中唯一的成员，具有独特的结构和生物学功能。新近临床研究发现，二酰甘油激酶E的功能缺失性突变是导致非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)的一个新的病理生理机制，我们的前期研究也发现DGKE在肾缺血再灌注引起的急性肾损伤中发挥保护作用，但二酰甘油激酶E是否参与缺血性脑损伤目前未见报道。
研究目的
本课题采用大脑中动脉栓塞法(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)建立小鼠实验性脑缺血再灌注损伤模型，并通过细胞糖氧剥夺法(Oxygen-glucosedeprivation，OGD)模拟体外缺氧环境，利用模式动物和RNA干扰等技术，借助于形态学、分子生物学、流式细胞术等方法，探究二酰甘油激酶E在体内外脑缺血再灌注损伤模型中的表达变化和作用，并初步探讨其发挥作用的分子生物学机制。
实验方法与结果
1.二酰甘油激酶E在小鼠各组织中的表达模式
分别使用PCR、蛋白免疫印迹法(Western blot，WB)检测二酰甘油激酶E在小鼠各组织中mRNA和蛋白表达水平，结果显示，二酰甘油激酶E在小鼠脑组织中存在表达。
2.二酰甘油激酶E在实验性脑缺血再灌注损伤后脑皮层的表达
选取鼠龄8-12w，体重为23±2g的野生型C57BL/6J小鼠，实验室条件下适应性饲养一周后随机分为假手术组(Sham)和脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI)模型组。通过大脑中动脉栓线阻断法构建小鼠实验性脑缺血模型，缺血两小时后实现再灌注。通过神经病学评分、脑梗死面积计算、形态学染色及TUNEL染色等方法，确定模型制备成功。
通过实时定量RT-PCR、蛋白免疫印迹法、免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)等方法，对小鼠脑皮层中的二酰甘油激酶E在不同分组小鼠脑皮层中的mRNA和蛋白表达水平进行检测，结果显示，与假手术组相比，脑缺血再灌注损伤后，缺血侧脑组织皮层中DGKE的表达显著降低。进一步通过免疫荧光(Immunofluorescence，IF)双标法确定二酰甘油激酶E的细胞定位。
3.二酰甘油激酶E在实验性脑缺血再灌注损伤中的作用
选用符合实验条件的二酰甘油激酶E基因过表达(Dgkeoverexpression，Rosa26-Dgke+/+)小鼠和野生型(Wide Type，WT)小鼠，分别构建实验性脑缺血再灌注损伤模型。
通过神经病学评分、脑梗死面积计算、HE染色、尼氏染色及TUNEL染色等方法发现，与野生组动物相比，过表达二酰甘油激酶E可显著改善脑缺血再灌注造成的神经行为学缺陷，缩小脑梗死面积，减轻缺血侧脑皮层的病理改变，增加存活的神经元数量，并减少缺血半暗带的凋亡细胞数。
分别使用脑星形胶质细胞和小胶质细胞的标志物GFAP和Iba-1对脑组织切片进行免疫荧光染色，结果显示，与假手术组相比，野生组小鼠在缺血再灌注后脑组织皮层半暗带中出现大量激活的星形胶质细胞和小胶质细胞，而过表达DGKE可显著降低脑缺血再灌注后星形胶质细胞和小胶质细胞的激活现象。
以上结果表明，过表达二酰甘油激酶E对实验性脑缺血再灌注损伤发挥保护作用。
4.过表达二酰甘油激酶E减轻缺血再灌注损伤后脑组织的炎症应答反应
分别使用实时定量RT-PCR和免疫荧光染色法检测脑组织中致炎细胞因子表达水平和炎性细胞浸润情况，结果显示，过表达DGKE可显著降低由缺血再灌注损伤引起的致炎细胞因子过度表达，并减少中性粒细胞和巨噬细胞的浸润，说明DGKE的神经保护作用可能与其减轻炎症反应有关。
5.二酰甘油激酶E在脑缺血再灌注损伤中的神经保护作用机制与抑制PKC通路有关
使用Westernblot法检测脑缺血再灌注损伤后脑皮层半暗带的PKC磷酸化水平，结果显示，与假手术组相比，缺血再灌注后野生组小鼠脑组织皮层半暗带中PKC的磷酸化水平显著升高，说明其被明显激活，而过表达DGKE可显著降低缺血脑组织中PKC的激活程度，初步说明DGKE的神经保护作用机制与抑制PKC通路有关。
体外实验也得到相似的结果。
结论与创新性
结论:脑缺血再灌注损伤后脑组织皮层中二酰甘油激酶E的表达降低，过表达DGKE后对实验性脑缺血再灌注损伤后发挥保护作用，该作用可能与抑制DAG-PKC通路、减轻缺血侧脑组织的炎症反应等机制有关。
创新性:本研究首次使用模式动物，通过体内外实验性脑缺血再灌注组损伤模型，明确了二酰甘油激酶E在缺血性脑损伤中的保护作用。本研究将为扩展二酰甘油激酶E的生物学功能、完善脑缺血再灌注损伤的病理生理学机制提供研究基础，并为临床开发针对缺血性脑血管病的有效干预策略提供启示。