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背景：
生长板是位于骨骺和骨干之间的软骨组织，组织内的软骨细胞不断分裂增殖，并从骨骺侧向骨干侧逐渐进行软骨内成骨，使骨延长生长。随着人体逐渐发育成熟，生长板不断骨化最终闭合。当骨折等外伤涉及到生长板时，就可能会导致生长板损伤(Growth Plate Injury, GPI)，由于软骨难以自行再生，在部分患者，这种损伤常常会导致病理性的骨性修复，并形成骨性骨痂(Bony Bar, BB)，从而造成骨生长停滞或成角畸形。
软骨是一种致密又有一定韧性的弹性组织，它广泛分布在靠近长骨两端的生长板和关节表面，另外，肋骨、耳朵、鼻子、支气管和椎间盘等部位都有软骨成分或由软骨构成。软骨组织由高度分化的软骨细胞及其产生的软骨细胞外基质组成，基质里面含有大量的蛋白多糖和弹性蛋白。软骨主要包括透明软骨、纤维软骨以及弹性软骨三种组织类型，彼此之间的胶原蛋白和蛋白多糖含量各不相同。生长板软骨就是一种透明软骨，在生长板内软骨细胞呈与长骨平行的柱状排列，在横向上，从骨骺端到干骺端，生长板被分为静息区、增殖区、肥厚区、骨化区四个层区。静息区软骨细胞旁干细胞不断增殖分化成新的软骨细胞，沿激素浓度梯度等环境的变化逐渐分化为骨组织。
很长一段时间以来，人们尝试各种方法修复和再生软骨组织，例如通过添加生物因子促进软骨细胞的增值，已经证实TGFβ3(Transforming Growth Factor, beta 3)及IGF-1(Insulin-like growth factor-1)等多种因子具有一定的促软骨生成作用。此外，利用组织工程的方法修复和再生软骨还一度引起了高度关注。一方面人们对软骨再生的需求度和迫切程度不断高涨，另一方面大家并不认为软骨组织的再生会出现困难。而近几十年来，人们逐渐发现之前错误的低估了软骨再生的难度。到目前为止，包括细胞治疗、基因治疗等在内的诸多研究，效果都差强人意，这其中较为突出的是关节面软骨的修复和再生。所以，对于较严重的关节面软骨病变，只能通过人工关节面置换这种创伤较大的方式来治疗，以换取二十年左右的关节功能，而对于较小的局部软骨损伤，目前临床上主要通过同种异体或自体软骨的移植来进行修复，但往往生成的是纤维软骨而无法发挥作用，或者再生出透明软骨，但很快形成了肥厚性软骨，很难再生出持续并且功能稳定的透明软骨。对于同样由透明软骨构成的生长板，其内的软骨结构更为复杂，所以涉及到生长板软骨损伤的治疗，就不仅仅是简单生成软骨即可，如何能够在募集或再生软骨细胞的同时，还能将其按照生长板软骨结构进行排列，继续和健康的软骨组织一起，发挥骨生长发育的生理功能，是生长板损伤相关研究亟待解决的问题。
近些年来，虽然有关生长板软骨损伤的机制和治疗方法的研究不断增多，尤其是在治疗方法的探索上，正沿着组织工程的方向不断刷新，通过测试不同生物材料，世界各国的科研机构都不断有新的研究发现，然而却很少看到有重大进展性科研成果。这一方面反映了软骨的再生尤其是像生长板组织这样有特殊结构的软骨组织再生的难度，另一方面，在回顾既往研究的过程中，也需要正视研究过程中的生长板损伤模型创建的诸多问题，并以此为新的出发点，将目光聚焦到更前沿的组织工程技术和产品，并转化到临床前研究当中来，更早实现其临床价值。
目的：
1.创建符合生长板损伤病理生理机制和临床特征的兔生长板损伤模型。
2.构建预期能够再生生长板样软骨的内嵌TGFβ3预混水凝胶的3D打印植入物。
3.测试上述3D打印植入物治疗生长板损伤，预防骨性修复并促进骨发育生长的效果。
方法：
第一部分，根据生长板损伤的发生机制，以及损伤后的临床特征，在既往相关研究的基础上，利用6周龄兔进行生长板损伤造模。
1.通过预实验分别损伤兔股骨远端生长板以及胫骨近端生长板，损伤范围为5mm*5mm*1mm，对比两个位置造模的优缺点，选定最佳造模部位。
2.预实验验证生长板软骨部分损伤3周以后骨痂的形成情况，通过micro-CT扫面评估骨痂形成的大小、部位变化等特点，为模型治疗提供思路。
3.通过规模实验验证生长板软骨部分损伤模型的合理性。经影像学(x-ray、micro-CT)评价损伤后对患侧胫骨延长生长和成角畸形的影响，同时测量双侧股骨、健侧胫骨，评估其差异，并通过给与不同治疗方式，观察治疗后模型的稳定性(即左侧胫骨长度的组间稳定性)。
第二部分，通过模拟生长板软骨组织的生物化学特性和物理空间结构特点，构建预期再生生长板软骨内嵌TGFβ3的预混拟生软骨样水凝胶3D打印植入物。
1.制作内嵌TGFβ3分子的水凝胶。
2.制作3D打印植入物。
第三部分，进行3D打印植入物的兔生长板软骨部分损伤后的治疗实验。
1.实验分为5个组：无植入物组、脂肪植入组、水凝胶植入组、3D打印材料+水凝胶植入组(简称3D组)、3D+水凝胶+骨髓间充质干细胞(Bone Marrow derived Stem Cells, BMMSCs)植入组。
2.造模方法按照第一部分的方法进行，在治疗后4周和8周时，分别进行影像学测量，并在8周后将动物安乐死，进行micro-CT扫描并组织学处理。
结果：
第一部分，通过预实验比较6周龄兔股骨远端和胫骨近端生长板软骨部分损伤两种造模方式，由于胫骨生长板结构相对更加平直，生长板容易定位，能够更加高效统一而准确的制造同样大小的损伤，最终选择胫骨近端前内测区损伤5mm*5mm*1mm大小范围为最终造模方式。经过造模后3周的micro-CT扫描评估，人为损伤的区域都存在骨性修复，并有骨痂形成，新形成的骨痂面积范围为6mm*6mm*2mm。通过X-ray影像测量，生长板软骨部分损伤3周后患侧(右侧)的胫骨长度短于健侧(左侧)，差异有统计学意义，所形成的畸形成角也与对侧有显著差异。在给予分组治疗4周及8周后，两个时间点测量左侧胫骨长度各组间均无差异。表明左侧胫骨的生长相对独立，不受右侧胫骨不同处理组的影响。
第二部分，通过对完整的兔原生胫骨近端生长板进行机械分析表明，生长板内不同区域其机械性能存在差异。静息区横向平面约为0.48MPa杨氏模量，增殖区和肥厚区约为0.26MPa杨氏模量。根据原生组织的这种机械特点，我们在3D打印过程中，设计出随深度层次而变换的阶梯函数，结合新型双激发材料的灰度控制，能够一次性打印出具有阶梯模量属性的3D打印材料。最终，我们打印出以柱状结构为支撑，结合10%硬性材料的产品，产品内90%的空间将用于为细胞提供生长空间。其最终杨氏模量为0.5MPa。
第三部分，按照分组进行治疗4周后，3D组患侧胫骨长度大于其它各组，继续生长到术后8周时，3D组患侧胫骨长度继续保持优势，并显著长于其它治疗组。计算各组两侧胫骨的长度差异(Limb Length Didscrepancy, LLD)后得出结论，术后4周及8周时，3D组的LLD在这两个时间点均为最小。3D组患侧胫骨的增长幅度在术后8周内增长幅度明显超过其他各组。对于成角畸形，术后8周没有观察到明显改善效果。而在micro-CT可以看出治疗8周后，untreated组损伤区有更多骨痂形成，而3D组骨痂相对较少，这与组织学的结果相一致，untreated组的骨痂形成范围更大，还呈现出连续性，即从健康生长板末端开始横贯整个损伤区，而其它治疗组相对不连续。而且在Hydrogel治疗组出现形状不规则的软骨包，在3D治疗组可以发现，在损伤区顶部，有连续的软骨样组织形成，并且同样有不规则形状的软骨样组织形成。而加入干细胞的治疗显示出更加明显的软骨再生效果，提示联合3D打印生物材料和干细胞的治疗方式或许产生更加理想的实验效果。
结论：
本研究建立的6周龄兔胫骨近端生长板软骨部分损伤模型合理模拟生长板损伤的病理生理机制及临床特征，并经过micro-CT和X-ray及组织学研究证实，损伤效果稳定一致，可作为后续生长板损伤相关研究的参考模型。在治疗4周后，预混水凝胶的3D打印植入组显著减小了双侧胫骨长度差异，治疗8周后，能够显著促进胫骨生长，减少骨痂的生成，并再生连续的软骨组织。而加入干细胞的治疗显示出更加明显的软骨再生效果，提示联合3D打印生物材料和干细胞植入的治疗方式或许产生更加理想的实验效果。
生长板是位于骨骺和骨干之间的软骨组织，组织内的软骨细胞不断分裂增殖，并从骨骺侧向骨干侧逐渐进行软骨内成骨，使骨延长生长。随着人体逐渐发育成熟，生长板不断骨化最终闭合。当骨折等外伤涉及到生长板时，就可能会导致生长板损伤(Growth Plate Injury, GPI)，由于软骨难以自行再生，在部分患者，这种损伤常常会导致病理性的骨性修复，并形成骨性骨痂(Bony Bar, BB)，从而造成骨生长停滞或成角畸形。
软骨是一种致密又有一定韧性的弹性组织，它广泛分布在靠近长骨两端的生长板和关节表面，另外，肋骨、耳朵、鼻子、支气管和椎间盘等部位都有软骨成分或由软骨构成。软骨组织由高度分化的软骨细胞及其产生的软骨细胞外基质组成，基质里面含有大量的蛋白多糖和弹性蛋白。软骨主要包括透明软骨、纤维软骨以及弹性软骨三种组织类型，彼此之间的胶原蛋白和蛋白多糖含量各不相同。生长板软骨就是一种透明软骨，在生长板内软骨细胞呈与长骨平行的柱状排列，在横向上，从骨骺端到干骺端，生长板被分为静息区、增殖区、肥厚区、骨化区四个层区。静息区软骨细胞旁干细胞不断增殖分化成新的软骨细胞，沿激素浓度梯度等环境的变化逐渐分化为骨组织。
很长一段时间以来，人们尝试各种方法修复和再生软骨组织，例如通过添加生物因子促进软骨细胞的增值，已经证实TGFβ3(Transforming Growth Factor, beta 3)及IGF-1(Insulin-like growth factor-1)等多种因子具有一定的促软骨生成作用。此外，利用组织工程的方法修复和再生软骨还一度引起了高度关注。一方面人们对软骨再生的需求度和迫切程度不断高涨，另一方面大家并不认为软骨组织的再生会出现困难。而近几十年来，人们逐渐发现之前错误的低估了软骨再生的难度。到目前为止，包括细胞治疗、基因治疗等在内的诸多研究，效果都差强人意，这其中较为突出的是关节面软骨的修复和再生。所以，对于较严重的关节面软骨病变，只能通过人工关节面置换这种创伤较大的方式来治疗，以换取二十年左右的关节功能，而对于较小的局部软骨损伤，目前临床上主要通过同种异体或自体软骨的移植来进行修复，但往往生成的是纤维软骨而无法发挥作用，或者再生出透明软骨，但很快形成了肥厚性软骨，很难再生出持续并且功能稳定的透明软骨。对于同样由透明软骨构成的生长板，其内的软骨结构更为复杂，所以涉及到生长板软骨损伤的治疗，就不仅仅是简单生成软骨即可，如何能够在募集或再生软骨细胞的同时，还能将其按照生长板软骨结构进行排列，继续和健康的软骨组织一起，发挥骨生长发育的生理功能，是生长板损伤相关研究亟待解决的问题。
近些年来，虽然有关生长板软骨损伤的机制和治疗方法的研究不断增多，尤其是在治疗方法的探索上，正沿着组织工程的方向不断刷新，通过测试不同生物材料，世界各国的科研机构都不断有新的研究发现，然而却很少看到有重大进展性科研成果。这一方面反映了软骨的再生尤其是像生长板组织这样有特殊结构的软骨组织再生的难度，另一方面，在回顾既往研究的过程中，也需要正视研究过程中的生长板损伤模型创建的诸多问题，并以此为新的出发点，将目光聚焦到更前沿的组织工程技术和产品，并转化到临床前研究当中来，更早实现其临床价值。
目的：
1.创建符合生长板损伤病理生理机制和临床特征的兔生长板损伤模型。
2.构建预期能够再生生长板样软骨的内嵌TGFβ3预混水凝胶的3D打印植入物。
3.测试上述3D打印植入物治疗生长板损伤，预防骨性修复并促进骨发育生长的效果。
方法：
第一部分，根据生长板损伤的发生机制，以及损伤后的临床特征，在既往相关研究的基础上，利用6周龄兔进行生长板损伤造模。
1.通过预实验分别损伤兔股骨远端生长板以及胫骨近端生长板，损伤范围为5mm*5mm*1mm，对比两个位置造模的优缺点，选定最佳造模部位。
2.预实验验证生长板软骨部分损伤3周以后骨痂的形成情况，通过micro-CT扫面评估骨痂形成的大小、部位变化等特点，为模型治疗提供思路。
3.通过规模实验验证生长板软骨部分损伤模型的合理性。经影像学(x-ray、micro-CT)评价损伤后对患侧胫骨延长生长和成角畸形的影响，同时测量双侧股骨、健侧胫骨，评估其差异，并通过给与不同治疗方式，观察治疗后模型的稳定性(即左侧胫骨长度的组间稳定性)。
第二部分，通过模拟生长板软骨组织的生物化学特性和物理空间结构特点，构建预期再生生长板软骨内嵌TGFβ3的预混拟生软骨样水凝胶3D打印植入物。
1.制作内嵌TGFβ3分子的水凝胶。
2.制作3D打印植入物。
第三部分，进行3D打印植入物的兔生长板软骨部分损伤后的治疗实验。
1.实验分为5个组：无植入物组、脂肪植入组、水凝胶植入组、3D打印材料+水凝胶植入组(简称3D组)、3D+水凝胶+骨髓间充质干细胞(Bone Marrow derived Stem Cells, BMMSCs)植入组。
2.造模方法按照第一部分的方法进行，在治疗后4周和8周时，分别进行影像学测量，并在8周后将动物安乐死，进行micro-CT扫描并组织学处理。
结果：
第一部分，通过预实验比较6周龄兔股骨远端和胫骨近端生长板软骨部分损伤两种造模方式，由于胫骨生长板结构相对更加平直，生长板容易定位，能够更加高效统一而准确的制造同样大小的损伤，最终选择胫骨近端前内测区损伤5mm*5mm*1mm大小范围为最终造模方式。经过造模后3周的micro-CT扫描评估，人为损伤的区域都存在骨性修复，并有骨痂形成，新形成的骨痂面积范围为6mm*6mm*2mm。通过X-ray影像测量，生长板软骨部分损伤3周后患侧(右侧)的胫骨长度短于健侧(左侧)，差异有统计学意义，所形成的畸形成角也与对侧有显著差异。在给予分组治疗4周及8周后，两个时间点测量左侧胫骨长度各组间均无差异。表明左侧胫骨的生长相对独立，不受右侧胫骨不同处理组的影响。
第二部分，通过对完整的兔原生胫骨近端生长板进行机械分析表明，生长板内不同区域其机械性能存在差异。静息区横向平面约为0.48MPa杨氏模量，增殖区和肥厚区约为0.26MPa杨氏模量。根据原生组织的这种机械特点，我们在3D打印过程中，设计出随深度层次而变换的阶梯函数，结合新型双激发材料的灰度控制，能够一次性打印出具有阶梯模量属性的3D打印材料。最终，我们打印出以柱状结构为支撑，结合10%硬性材料的产品，产品内90%的空间将用于为细胞提供生长空间。其最终杨氏模量为0.5MPa。
第三部分，按照分组进行治疗4周后，3D组患侧胫骨长度大于其它各组，继续生长到术后8周时，3D组患侧胫骨长度继续保持优势，并显著长于其它治疗组。计算各组两侧胫骨的长度差异(Limb Length Didscrepancy, LLD)后得出结论，术后4周及8周时，3D组的LLD在这两个时间点均为最小。3D组患侧胫骨的增长幅度在术后8周内增长幅度明显超过其他各组。对于成角畸形，术后8周没有观察到明显改善效果。而在micro-CT可以看出治疗8周后，untreated组损伤区有更多骨痂形成，而3D组骨痂相对较少，这与组织学的结果相一致，untreated组的骨痂形成范围更大，还呈现出连续性，即从健康生长板末端开始横贯整个损伤区，而其它治疗组相对不连续。而且在Hydrogel治疗组出现形状不规则的软骨包，在3D治疗组可以发现，在损伤区顶部，有连续的软骨样组织形成，并且同样有不规则形状的软骨样组织形成。而加入干细胞的治疗显示出更加明显的软骨再生效果，提示联合3D打印生物材料和干细胞的治疗方式或许产生更加理想的实验效果。
结论：
本研究建立的6周龄兔胫骨近端生长板软骨部分损伤模型合理模拟生长板损伤的病理生理机制及临床特征，并经过micro-CT和X-ray及组织学研究证实，损伤效果稳定一致，可作为后续生长板损伤相关研究的参考模型。在治疗4周后，预混水凝胶的3D打印植入组显著减小了双侧胫骨长度差异，治疗8周后，能够显著促进胫骨生长，减少骨痂的生成，并再生连续的软骨组织。而加入干细胞的治疗显示出更加明显的软骨再生效果，提示联合3D打印生物材料和干细胞植入的治疗方式或许产生更加理想的实验效果。