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研究背景和目的：
Burkitt淋巴瘤(Burkitt lymphoma，BL)是属于B细胞来源的非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma，NHL)，由DenisBurkitt于1958年首先报道，是常见的具有高度侵袭性的淋巴系统恶性肿瘤之一。由于其倍增速度快、恶性程度高、侵袭范围广，而被称为肿瘤急症，需要积极应用抑制肿瘤细胞生长和耐药的高强度的化疗药物以达到抑制肿瘤细胞快速增殖以及减轻机体器官损伤的目的。临床上长期以来通过对Burkitt淋巴瘤的研究表明，决定患者疗效的关键是在初次疗程中药物的选择，应用疗程较短、强度较高的化疗方案，可能取得较为良好的治疗效果，但这些药物往往伴有较强的毒副作用，一些年龄偏大以及抵抗力较低的的患者往往难以耐受。同时对于复发难治性的Burkitt淋巴瘤，在临床上的治疗效果更不理想。因此，寻找新的治疗药物是临床医生及科研工作者急需解决的问题。
细胞无限制的增殖是导致恶性肿瘤发生的主要因素之一，而细胞周期的失调与细胞增殖的失控有着密切的联系。细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin dependent kinase，CDK)在细胞周期的调控中起到关键作用，CDK、细胞周期蛋白(Cyclin)以及周期蛋白依赖性激酶抑制因子(Cyclin dependent kinase inhibitor，CKI)三者相互作用，形成调控网络，共同控制着有丝分裂细胞的周期进程。CDK的表达量在部分肿瘤细胞中往往升高，这就为我们从细胞周期的角度深入研究恶性肿瘤的发病机制以及开发有效的抗癌药物提供了理论基础。针对不同种类的CDK抑制剂正在研发之中，有的已经进入临床试验，其中一些CDK抑制剂能够抑制包括淋巴瘤在内的多种血液系统恶性肿瘤细胞的生长、促进凋亡。提示针对CDK的抑制剂在Burkitt淋巴瘤中可能起到一定的抗肿瘤作用，值得进一步研究。
Dinaciclib(MK-7965，SCH-727965)是一种新型的CDK抑制剂，它可以选择性地抑制多种CDK(CDK1，CDK2，CDK5和CDK9)的活性，作为第二代CDK抑制剂，相比于第一代具有更明显的生物学优势并可以在体内外抑制多种肿瘤细胞的生长。其在一部分血液系统肿瘤中已进入I/II期临床试验，初步显示出一定的治疗效果。但在Burkitt淋巴瘤中，Dinaciclib对肿瘤细胞增殖、凋亡、周期分布、耐药的影响以及相关作用靶点和作用机制尚未见报道。
本研究以Burkitt淋巴瘤为研究对象，探讨Dinaciclib的抗肿瘤作用及相关作用机制，为今后Burkitt淋巴瘤的治疗提供实验室依据，从而有助于改善该疾病的治疗效果。
本研究主要分为以下三个部分：
第一部分Dinaciclib对Burkitt淋巴瘤Raji及Ramos细胞系的生物学作用
方法：
1.以Raji及Ramos两种Burkitt淋巴瘤细胞系为研究对象，采用MTT法检测在不同浓度梯度的Dinaciclib、顺铂以及两者联合应用的条件下细胞增殖能力的变化，评价Dinaciclib与顺铂的协同效应。同时Dinaciclib及顺铂单独作用于正常人胚肾293T细胞后检测其对正常细胞的毒性作用。
2.Dinaciclib作用于Raji及Ramos两种细胞系后，克隆形成实验检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞周期，应用Caspase-3/7活性检测试剂盒检测Caspase-3/7的活性，流式细胞术和TUNEL实验分别检测细胞凋亡，Westernblotting检测CDK1、p-CDK1、CyclinD3、cleavedPARP和cleavedCaspase-3蛋白的表达。
结果：
1.不同浓度梯度的Dinaciclib及顺铂分别作用于Raji及Ramos细胞72h后，两者均呈剂量依赖性地抑制两种细胞的增殖。在Raji细胞中，Dinaciclib的IC50值为0.011±0.0031μM(Mean±SD)，顺铂的IC50值为10.490±1.1936μM(Mean±SD)。在Ramos细胞中，Dinaciclib的IC50值为0.009±0.0027μM(Mean±SD)，顺铂的IC50值为13.008±2.912μM(Mean±SD)。两种药物对正常人胚肾293T细胞的IC50值分别为2.045±0.948μM(Mean±SD)和21.524±3.075μM(Mean±SD)。在不同浓度Dinaciclib和顺铂的联合作用下，与单独应用相比，细胞存活率显著降低，且对于两种细胞系，药物联合治疗的CDI值＜1。
2.经Dinaciclib处理后，与对照组相比，Raji及Ramos两种细胞系的克隆形成数均减少(P＜0.05)，处于G2/M期的细胞数均增多(P＜0.05)，凋亡相关酶Caspase-3/7活性均增加(P＜0.05)，细胞凋亡率均增加(P＜0.05)。CDK1、p-CDK1蛋白表达均下降(P＜0.05)，细胞周期相关蛋白CyclinD3的表达均下降(P＜0.05)，凋亡相关蛋白cleavedPARP和cleavedCaspase-3的表达均升高(P＜0.05)。
小结：
1.对于Raji及Ramos这两种细胞系，与顺铂相比，Dinaciclib能更有效地抑制细胞的增殖，而且对肿瘤细胞的毒性作用高于正常人胚肾293T细胞，同时Dinaciclib与顺铂两者在联用时可以显示出协同作用。
2.Dinaciclib能够将Raji及Ramos细胞更多地阻滞于G2/M期并促进细胞凋亡，并能够降低CDK1、p-CDK1、CyclinD3蛋白的表达而升高cleavedPARP、cleavedCaspase-3蛋白的表达。
第二部分Dinaciclib作用于Raji细胞及Raji/Dinaciclib耐药细胞的相关分子机制
方法：
1.采用逐步提高培养液中Dinaciclib的浓度的方法长期诱导建立Dinaciclib耐药的Raji/Dinaciclib细胞系。
2.通过对Raji细胞系及Raji/dinaciclib耐药细胞系运用基因表达谱芯片技术分析两者之间的差异表达基因并进行聚类分析，运用GO分析和KEGG通路富集等生物信息学方法分析与差异表达基因有关的生物学功能和信号通路，利用STRING数据库在线软件分析差异基因表达蛋白之间的相互作用关系。
3.Westernblotting检测Raji及Raji/Dinaciclib细胞中CDK1及Survivin蛋白的表达。
4.将pcDNA3.1-CDK1，pcDNA3.1-CDK1siRNA，pcDNA3.1-Survivin，pcDNA3.1-SurvivinsiRNA通过Lipofectamine3000分别对Raji细胞进行转染；pcDNA3.1-CDK1siRNA，pcDNA3.1-SurvivinsiRNA分别对Raji/dinaciclib细胞进行转染。
5.将Raji细胞分为阴性对照组、Dinaciclib组、CDK1siRNA组、Dinaciclib+CDK1siRNA组、CDK1cDNA组和Dinaciclib+CDK1cDNA组，应用qRT-PCR检测各组CDK1mRNA的表达，同时应用Westernblotting检测各组CDK1蛋白的表达，克隆形成实验检测各组细胞增殖能力，流式细胞术检测各组细胞周期，应用Caspase-3/7活性检测试剂盒检测各组Caspase-3/7的活性，流式细胞术及TUNEL分别检测细胞凋亡。
6.将Raji细胞分为阴性对照组、Dinaciclib组、SurvivinsiRNA组、Dinaciclib+SurvivinsiRNA组、SurvivincDNA组和Dinaciclib+SurvivincDNA组，应用qRT-PCR检测各组SurvivinmRNA的表达，同时应用Westernblotting检测各组Survivin蛋白的表达，克隆形成实验检测各组细胞增殖能力，流式细胞术检测各组细胞周期，应用Caspase-3/7活性检测试剂盒检测各组Caspase-3/7的活性，流式细胞术及TUNEL分别检测细胞凋亡。
7.将Raji/Dinaciclib细胞分为阴性对照组、Dinaciclib组、CDK1siRNA组和Dinaciclib+CDK1siRNA组，应用Westernblotting检测各组CDK1蛋白的表达，克隆形成实验检测各组细胞增殖能力，流式细胞术检测各组细胞周期，应用Caspase-3/7活性检测试剂盒检测各组Caspase-3/7的活性，流式细胞术及TUNEL分别检测细胞凋亡。
8.将Raji/Dinaciclib细胞分为阴性对照组、Dinaciclib组、SurvivinsiRNA组和Dinaciclib+SurvivinsiRNA组，应用Westernblotting检测Survivin蛋白的表达，克隆形成实验检测各组细胞增殖能力，流式细胞术检测各组细胞周期，应用Caspase-3/7活性检测试剂盒检测各组Caspase-3/7的活性，流式细胞术及TUNEL分别检测细胞凋亡。
结果
1.成功建立了Dinaciclib耐药的Raji/Dinaciclib细胞系。
2.Raji和Raji/Dinaciclib细胞的聚类分析结果显示：差异表达基因共179个，相对于Raji细胞，Raji/Dinaciclib细胞上调基因134个，下调基因45个。其中CDK1、BIRC5(Survivin)在上调基因中差异明显，分别上调约2.83及2.79倍(P＜0.05)，而LDLRAD1基因在下调基因中差异最明显，约下调2.91倍(P＜0.05)。GO分析提示差异基因主要富集于细胞有丝分裂间期转换、有丝分裂调控等生物学过程，主要与着丝粒、纺锤体、细胞周期依赖性蛋白激酶等细胞成分及相关活化过程有关。KEGG通路分析得出细胞周期相关通路明显富集。PPI结果显示CDK1、BIRC5(Survivin)、CDK2、CDK6、CCNA2、MYC、BCL2、BAX等基因编码的蛋白存在相互作用关系，为差异基因编码的核心蛋白质。综合分析，选取CDK1与BIRC5(Survivin)作为后续研究的对象。
3.与Raji细胞相比，Raji/Dinaciclib细胞中CDK1、Survivin蛋白表达量增加(P＜0.05)。
4.在Raji细胞中，与阴性对照组相比，Dinaciclib及CDK1siRNA处理组CDK1mRNA、蛋白表达下降(P＜0.05)，细胞克隆形成数减少(P＜0.05)，细胞较多阻滞于G2/M期(P＜0.05)，凋亡相关酶Caspase-3/7活性增加(P＜0.05)，细胞凋亡率增加(P＜0.05)；CDK1cDNA处理组CDK1mRNA、蛋白表达上升(P＜0.05)，细胞克隆形成数增加(P＜0.05)，G2/M期细胞数减少(P＜0.05)，凋亡相关酶Caspase-3/7活性降低(P＜0.05)，细胞凋亡率降低(P＜0.05)。与Dinaciclib或CDK1siRNA处理组相比，Dinaciclib+CDK1siRNA组中CDK1mRNA、蛋白表达下降(P＜0.05)，细胞克隆形成数减少(P＜0.05)，细胞较多阻滞于G2/M期(P＜0.05)，凋亡相关酶Caspase-3/7活性增加(P＜0.05)，细胞凋亡率增加(P＜0.05)。与CDK1cDNA处理组相比，Dinaciclib+CDK1cDNA组中CDK1mRNA、蛋白表达下降(P＜0.05)，细胞克隆形成数减少(P＜0.05)，细胞较多阻滞于G2/M期(P＜0.05)，凋亡相关酶Caspase-3/7活性增加(P＜0.05)，细胞凋亡率增加(P＜0.05)。与阴性对照组相比，Dinaciclib+CDK1cDNA组中，CDK1mRNA及蛋白的表达、细胞克隆形成数、G2/M期细胞数、凋亡相关酶Caspase-3/7活性、细胞凋亡率均无明显差异(P＞0.05)。
5.在Raji细胞中，与阴性对照组相比，Dinaciclib及SurvivinsiRNA处理组SurvivinmRNA、蛋白表达下降(P＜0.05)，细胞克隆形成数减少(P＜0.05)，细胞较多阻滞于G2/M期(P＜0.05)，凋亡相关酶Caspase-3/7活性增加(P＜0.05)，细胞凋亡率增加(P＜0.05)；SurvivincDNA处理组SurvivinmRNA、蛋白表达上升(P＜0.05)，细胞克隆形成数增加(P＜0.05)，G2/M期细胞数减少(P＜0.05)，凋亡相关酶Caspase-3/7活性降低(P＜0.05)，细胞凋亡率降低(P＜0.05)。与Dinaciclib或SurvivinsiRNA处理组相比，Dinaciclib+SurvivinsiRNA组中SurvivinmRNA、蛋白表达下降(P＜0.05)，细胞克隆形成数减少(P＜0.05)，细胞较多阻滞于G2/M期(P＜0.05)，凋亡相关酶Caspase-3/7活性增加(P＜0.05)，细胞凋亡率增加(P＜0.05)。与SurvivincDNA处理组相比，Dinaciclib+SurvivincDNA组中SurvivinmRNA、蛋白表达下降(P＜0.05)，细胞克隆形成数减少(P＜0.05)，细胞较多阻滞于G2/M期(P＜0.05)，凋亡相关酶Caspase-3/7活性增加(P＜0.05)，细胞凋亡率增加(P＜0.05)。与阴性对照组相比，Dinaciclib+SurvivincDNA组中，SurvivinmRNA、蛋白的表达、细胞克隆形成数、G2/M期细胞数、凋亡相关酶Caspase-3/7活性、细胞凋亡率均无明显差异(P＞0.05)。
6.在Raji/Dinaciclib细胞中，与阴性对照组相比，Dinaciclib处理组中，CDK1蛋白的表达、细胞克隆形成数、G2/M期细胞数、凋亡相关酶Caspase-3/7活性、细胞凋亡率均无明显差异(P＞0.05)。与Dinaciclib处理组相比，CDK1siRNA组CDK1蛋白表达下降(P＜0.05)，细胞克隆形成数减少(P＜0.05)，细胞较多阻滞于G2/M期(P＜0.05)，凋亡相关酶Caspase-3/7活性增加(P＜0.05)，细胞凋亡率增加(P＜0.05)。与CDK1siRNA组相比，Dinaciclib+CDK1siRNA组CDK1蛋白表达下降(P＜0.05)，细胞克隆形成数减少(P＜0.05)，细胞较多阻滞于G2/M期(P＜0.05)，凋亡相关酶Caspase-3/7活性增加(P＜0.05)，细胞凋亡率增加(P＜0.05)。
7.在Raji/Dinaciclib细胞中，与阴性对照组相比，Dinaciclib处理组中，Survivin蛋白的表达、细胞克隆形成数、G2/M期细胞数、凋亡相关酶Caspase-3/7活性、细胞凋亡率均无明显差异(P＞0.05)。与Dinaciclib处理组相比，SurvivinsiRNA组Survivin蛋白表达下降(P＜0.05)，细胞克隆形成数减少(P＜0.05)，细胞较多阻滞于G2/M期(P＜0.05)，凋亡相关酶Caspase-3/7活性增加(P＜0.05)，细胞凋亡率增加(P＜0.05)。与SurvivinsiRNA组相比，Dinaciclib+SurvivinsiRNA组Survivin蛋白表达下降(P＜0.05)，细胞克隆形成数减少(P＜0.05)，细胞较多阻滞于G2/M期(P＜0.05)，凋亡相关酶Caspase-3/7活性增加(P＜0.05)，细胞凋亡率增加(P＜0.05)。
小结：
1.CDK1与Survivin的表达增加可能为Raji/Dinaciclib耐药的原因，细胞周期相关通路可能与Raji/Dinaciclib耐药密切相关。
2.敲低Raji/Dinaciclib耐药细胞中CDK1或Survivin的表达，可以增加Dinaciclib的药物敏感性。
3.Dinaciclib可以部分通过作用于CDK1及Survivin而发挥抑制Burkitt淋巴瘤Raji细胞增殖以及促凋亡作用。
第三部分Dinaciclib对Raji细胞裸鼠移植瘤的抗肿瘤作用
方法：
1.在裸鼠的右腋下行皮下注射Raji细胞(2×106/小鼠)来建立小鼠异种移植瘤模型，实验组每隔一天根据体重腹腔内注射Dinaciclib(3mg/kg)，对照组给予生理盐水。每隔5天用游标卡尺测量瘤体大小并计算瘤体体积，在第25天处死小鼠并剥离瘤体，进行称重。
2.制作瘤体组织切片，行H&E染色及TUNEL实验，进一步采用免疫组化方法检测Ki-67的表达情况。
3.Westernblotting检测瘤体组织中CDK1、Survivin、p-mTOR、p21、Bcl-2、Bax蛋白的表达。
结果：
1.成功建立Raji细胞小鼠异种移植瘤模型，与对照组相比，Dinaciclib处理组瘤体体积减小(P＜0.05)，重量减轻(P＜0.05)。
2.与对照组相比，Dinaciclib组Ki-67阳性的细胞数减少(P＜0.05)，细胞凋亡率增加(P＜0.05)，CDK1、Survivin、p-mTOR和Bcl-2蛋白表达减少(P＜0.05)，p21、Bax蛋白表达升高(P＜0.05)。
小结：
1.Dinaciclib能够抑制裸鼠Raji细胞移植瘤的生长，同时能够抑制细胞增殖、促进凋亡。
2.Dinaciclib在裸鼠体内抗Raji细胞移植瘤效应部分通过作用于CDK1、Survivin、p-mTOR、Bcl-2、Bax、p21的表达来实现。
结论：
1.在Burkitt淋巴瘤Raji及Ramos细胞中，Dinaciclib能够有效地抑制细胞增殖、促进凋亡，并与顺铂有协同作用。
2.CDK1与Survivin的表达增加可能为Raji/Dinaciclib耐药的原因，敲低Raji/Dinaciclib耐药细胞中CDK1或Survivin的表达，可以增加Dinaciclib的药物敏感性，Dinaciclib部分通过作用于CDK1及Survivin而发挥抑制Raji细胞增殖以及促凋亡作用，CDK1与Survivin有可能成为Dinaciclib作用于Burkitt淋巴瘤的靶点之一。
3.Dinaciclib在体内对裸鼠Raji细胞移植瘤具有抗肿瘤作用。
Burkitt淋巴瘤(Burkitt lymphoma，BL)是属于B细胞来源的非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma，NHL)，由DenisBurkitt于1958年首先报道，是常见的具有高度侵袭性的淋巴系统恶性肿瘤之一。由于其倍增速度快、恶性程度高、侵袭范围广，而被称为肿瘤急症，需要积极应用抑制肿瘤细胞生长和耐药的高强度的化疗药物以达到抑制肿瘤细胞快速增殖以及减轻机体器官损伤的目的。临床上长期以来通过对Burkitt淋巴瘤的研究表明，决定患者疗效的关键是在初次疗程中药物的选择，应用疗程较短、强度较高的化疗方案，可能取得较为良好的治疗效果，但这些药物往往伴有较强的毒副作用，一些年龄偏大以及抵抗力较低的的患者往往难以耐受。同时对于复发难治性的Burkitt淋巴瘤，在临床上的治疗效果更不理想。因此，寻找新的治疗药物是临床医生及科研工作者急需解决的问题。
细胞无限制的增殖是导致恶性肿瘤发生的主要因素之一，而细胞周期的失调与细胞增殖的失控有着密切的联系。细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin dependent kinase，CDK)在细胞周期的调控中起到关键作用，CDK、细胞周期蛋白(Cyclin)以及周期蛋白依赖性激酶抑制因子(Cyclin dependent kinase inhibitor，CKI)三者相互作用，形成调控网络，共同控制着有丝分裂细胞的周期进程。CDK的表达量在部分肿瘤细胞中往往升高，这就为我们从细胞周期的角度深入研究恶性肿瘤的发病机制以及开发有效的抗癌药物提供了理论基础。针对不同种类的CDK抑制剂正在研发之中，有的已经进入临床试验，其中一些CDK抑制剂能够抑制包括淋巴瘤在内的多种血液系统恶性肿瘤细胞的生长、促进凋亡。提示针对CDK的抑制剂在Burkitt淋巴瘤中可能起到一定的抗肿瘤作用，值得进一步研究。
Dinaciclib(MK-7965，SCH-727965)是一种新型的CDK抑制剂，它可以选择性地抑制多种CDK(CDK1，CDK2，CDK5和CDK9)的活性，作为第二代CDK抑制剂，相比于第一代具有更明显的生物学优势并可以在体内外抑制多种肿瘤细胞的生长。其在一部分血液系统肿瘤中已进入I/II期临床试验，初步显示出一定的治疗效果。但在Burkitt淋巴瘤中，Dinaciclib对肿瘤细胞增殖、凋亡、周期分布、耐药的影响以及相关作用靶点和作用机制尚未见报道。
本研究以Burkitt淋巴瘤为研究对象，探讨Dinaciclib的抗肿瘤作用及相关作用机制，为今后Burkitt淋巴瘤的治疗提供实验室依据，从而有助于改善该疾病的治疗效果。
本研究主要分为以下三个部分：
第一部分Dinaciclib对Burkitt淋巴瘤Raji及Ramos细胞系的生物学作用
方法：
1.以Raji及Ramos两种Burkitt淋巴瘤细胞系为研究对象，采用MTT法检测在不同浓度梯度的Dinaciclib、顺铂以及两者联合应用的条件下细胞增殖能力的变化，评价Dinaciclib与顺铂的协同效应。同时Dinaciclib及顺铂单独作用于正常人胚肾293T细胞后检测其对正常细胞的毒性作用。
2.Dinaciclib作用于Raji及Ramos两种细胞系后，克隆形成实验检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞周期，应用Caspase-3/7活性检测试剂盒检测Caspase-3/7的活性，流式细胞术和TUNEL实验分别检测细胞凋亡，Westernblotting检测CDK1、p-CDK1、CyclinD3、cleavedPARP和cleavedCaspase-3蛋白的表达。
结果：
1.不同浓度梯度的Dinaciclib及顺铂分别作用于Raji及Ramos细胞72h后，两者均呈剂量依赖性地抑制两种细胞的增殖。在Raji细胞中，Dinaciclib的IC50值为0.011±0.0031μM(Mean±SD)，顺铂的IC50值为10.490±1.1936μM(Mean±SD)。在Ramos细胞中，Dinaciclib的IC50值为0.009±0.0027μM(Mean±SD)，顺铂的IC50值为13.008±2.912μM(Mean±SD)。两种药物对正常人胚肾293T细胞的IC50值分别为2.045±0.948μM(Mean±SD)和21.524±3.075μM(Mean±SD)。在不同浓度Dinaciclib和顺铂的联合作用下，与单独应用相比，细胞存活率显著降低，且对于两种细胞系，药物联合治疗的CDI值＜1。
2.经Dinaciclib处理后，与对照组相比，Raji及Ramos两种细胞系的克隆形成数均减少(P＜0.05)，处于G2/M期的细胞数均增多(P＜0.05)，凋亡相关酶Caspase-3/7活性均增加(P＜0.05)，细胞凋亡率均增加(P＜0.05)。CDK1、p-CDK1蛋白表达均下降(P＜0.05)，细胞周期相关蛋白CyclinD3的表达均下降(P＜0.05)，凋亡相关蛋白cleavedPARP和cleavedCaspase-3的表达均升高(P＜0.05)。
小结：
1.对于Raji及Ramos这两种细胞系，与顺铂相比，Dinaciclib能更有效地抑制细胞的增殖，而且对肿瘤细胞的毒性作用高于正常人胚肾293T细胞，同时Dinaciclib与顺铂两者在联用时可以显示出协同作用。
2.Dinaciclib能够将Raji及Ramos细胞更多地阻滞于G2/M期并促进细胞凋亡，并能够降低CDK1、p-CDK1、CyclinD3蛋白的表达而升高cleavedPARP、cleavedCaspase-3蛋白的表达。
第二部分Dinaciclib作用于Raji细胞及Raji/Dinaciclib耐药细胞的相关分子机制
方法：
1.采用逐步提高培养液中Dinaciclib的浓度的方法长期诱导建立Dinaciclib耐药的Raji/Dinaciclib细胞系。
2.通过对Raji细胞系及Raji/dinaciclib耐药细胞系运用基因表达谱芯片技术分析两者之间的差异表达基因并进行聚类分析，运用GO分析和KEGG通路富集等生物信息学方法分析与差异表达基因有关的生物学功能和信号通路，利用STRING数据库在线软件分析差异基因表达蛋白之间的相互作用关系。
3.Westernblotting检测Raji及Raji/Dinaciclib细胞中CDK1及Survivin蛋白的表达。
4.将pcDNA3.1-CDK1，pcDNA3.1-CDK1siRNA，pcDNA3.1-Survivin，pcDNA3.1-SurvivinsiRNA通过Lipofectamine3000分别对Raji细胞进行转染；pcDNA3.1-CDK1siRNA，pcDNA3.1-SurvivinsiRNA分别对Raji/dinaciclib细胞进行转染。
5.将Raji细胞分为阴性对照组、Dinaciclib组、CDK1siRNA组、Dinaciclib+CDK1siRNA组、CDK1cDNA组和Dinaciclib+CDK1cDNA组，应用qRT-PCR检测各组CDK1mRNA的表达，同时应用Westernblotting检测各组CDK1蛋白的表达，克隆形成实验检测各组细胞增殖能力，流式细胞术检测各组细胞周期，应用Caspase-3/7活性检测试剂盒检测各组Caspase-3/7的活性，流式细胞术及TUNEL分别检测细胞凋亡。
6.将Raji细胞分为阴性对照组、Dinaciclib组、SurvivinsiRNA组、Dinaciclib+SurvivinsiRNA组、SurvivincDNA组和Dinaciclib+SurvivincDNA组，应用qRT-PCR检测各组SurvivinmRNA的表达，同时应用Westernblotting检测各组Survivin蛋白的表达，克隆形成实验检测各组细胞增殖能力，流式细胞术检测各组细胞周期，应用Caspase-3/7活性检测试剂盒检测各组Caspase-3/7的活性，流式细胞术及TUNEL分别检测细胞凋亡。
7.将Raji/Dinaciclib细胞分为阴性对照组、Dinaciclib组、CDK1siRNA组和Dinaciclib+CDK1siRNA组，应用Westernblotting检测各组CDK1蛋白的表达，克隆形成实验检测各组细胞增殖能力，流式细胞术检测各组细胞周期，应用Caspase-3/7活性检测试剂盒检测各组Caspase-3/7的活性，流式细胞术及TUNEL分别检测细胞凋亡。
8.将Raji/Dinaciclib细胞分为阴性对照组、Dinaciclib组、SurvivinsiRNA组和Dinaciclib+SurvivinsiRNA组，应用Westernblotting检测Survivin蛋白的表达，克隆形成实验检测各组细胞增殖能力，流式细胞术检测各组细胞周期，应用Caspase-3/7活性检测试剂盒检测各组Caspase-3/7的活性，流式细胞术及TUNEL分别检测细胞凋亡。
结果
1.成功建立了Dinaciclib耐药的Raji/Dinaciclib细胞系。
2.Raji和Raji/Dinaciclib细胞的聚类分析结果显示：差异表达基因共179个，相对于Raji细胞，Raji/Dinaciclib细胞上调基因134个，下调基因45个。其中CDK1、BIRC5(Survivin)在上调基因中差异明显，分别上调约2.83及2.79倍(P＜0.05)，而LDLRAD1基因在下调基因中差异最明显，约下调2.91倍(P＜0.05)。GO分析提示差异基因主要富集于细胞有丝分裂间期转换、有丝分裂调控等生物学过程，主要与着丝粒、纺锤体、细胞周期依赖性蛋白激酶等细胞成分及相关活化过程有关。KEGG通路分析得出细胞周期相关通路明显富集。PPI结果显示CDK1、BIRC5(Survivin)、CDK2、CDK6、CCNA2、MYC、BCL2、BAX等基因编码的蛋白存在相互作用关系，为差异基因编码的核心蛋白质。综合分析，选取CDK1与BIRC5(Survivin)作为后续研究的对象。
3.与Raji细胞相比，Raji/Dinaciclib细胞中CDK1、Survivin蛋白表达量增加(P＜0.05)。
4.在Raji细胞中，与阴性对照组相比，Dinaciclib及CDK1siRNA处理组CDK1mRNA、蛋白表达下降(P＜0.05)，细胞克隆形成数减少(P＜0.05)，细胞较多阻滞于G2/M期(P＜0.05)，凋亡相关酶Caspase-3/7活性增加(P＜0.05)，细胞凋亡率增加(P＜0.05)；CDK1cDNA处理组CDK1mRNA、蛋白表达上升(P＜0.05)，细胞克隆形成数增加(P＜0.05)，G2/M期细胞数减少(P＜0.05)，凋亡相关酶Caspase-3/7活性降低(P＜0.05)，细胞凋亡率降低(P＜0.05)。与Dinaciclib或CDK1siRNA处理组相比，Dinaciclib+CDK1siRNA组中CDK1mRNA、蛋白表达下降(P＜0.05)，细胞克隆形成数减少(P＜0.05)，细胞较多阻滞于G2/M期(P＜0.05)，凋亡相关酶Caspase-3/7活性增加(P＜0.05)，细胞凋亡率增加(P＜0.05)。与CDK1cDNA处理组相比，Dinaciclib+CDK1cDNA组中CDK1mRNA、蛋白表达下降(P＜0.05)，细胞克隆形成数减少(P＜0.05)，细胞较多阻滞于G2/M期(P＜0.05)，凋亡相关酶Caspase-3/7活性增加(P＜0.05)，细胞凋亡率增加(P＜0.05)。与阴性对照组相比，Dinaciclib+CDK1cDNA组中，CDK1mRNA及蛋白的表达、细胞克隆形成数、G2/M期细胞数、凋亡相关酶Caspase-3/7活性、细胞凋亡率均无明显差异(P＞0.05)。
5.在Raji细胞中，与阴性对照组相比，Dinaciclib及SurvivinsiRNA处理组SurvivinmRNA、蛋白表达下降(P＜0.05)，细胞克隆形成数减少(P＜0.05)，细胞较多阻滞于G2/M期(P＜0.05)，凋亡相关酶Caspase-3/7活性增加(P＜0.05)，细胞凋亡率增加(P＜0.05)；SurvivincDNA处理组SurvivinmRNA、蛋白表达上升(P＜0.05)，细胞克隆形成数增加(P＜0.05)，G2/M期细胞数减少(P＜0.05)，凋亡相关酶Caspase-3/7活性降低(P＜0.05)，细胞凋亡率降低(P＜0.05)。与Dinaciclib或SurvivinsiRNA处理组相比，Dinaciclib+SurvivinsiRNA组中SurvivinmRNA、蛋白表达下降(P＜0.05)，细胞克隆形成数减少(P＜0.05)，细胞较多阻滞于G2/M期(P＜0.05)，凋亡相关酶Caspase-3/7活性增加(P＜0.05)，细胞凋亡率增加(P＜0.05)。与SurvivincDNA处理组相比，Dinaciclib+SurvivincDNA组中SurvivinmRNA、蛋白表达下降(P＜0.05)，细胞克隆形成数减少(P＜0.05)，细胞较多阻滞于G2/M期(P＜0.05)，凋亡相关酶Caspase-3/7活性增加(P＜0.05)，细胞凋亡率增加(P＜0.05)。与阴性对照组相比，Dinaciclib+SurvivincDNA组中，SurvivinmRNA、蛋白的表达、细胞克隆形成数、G2/M期细胞数、凋亡相关酶Caspase-3/7活性、细胞凋亡率均无明显差异(P＞0.05)。
6.在Raji/Dinaciclib细胞中，与阴性对照组相比，Dinaciclib处理组中，CDK1蛋白的表达、细胞克隆形成数、G2/M期细胞数、凋亡相关酶Caspase-3/7活性、细胞凋亡率均无明显差异(P＞0.05)。与Dinaciclib处理组相比，CDK1siRNA组CDK1蛋白表达下降(P＜0.05)，细胞克隆形成数减少(P＜0.05)，细胞较多阻滞于G2/M期(P＜0.05)，凋亡相关酶Caspase-3/7活性增加(P＜0.05)，细胞凋亡率增加(P＜0.05)。与CDK1siRNA组相比，Dinaciclib+CDK1siRNA组CDK1蛋白表达下降(P＜0.05)，细胞克隆形成数减少(P＜0.05)，细胞较多阻滞于G2/M期(P＜0.05)，凋亡相关酶Caspase-3/7活性增加(P＜0.05)，细胞凋亡率增加(P＜0.05)。
7.在Raji/Dinaciclib细胞中，与阴性对照组相比，Dinaciclib处理组中，Survivin蛋白的表达、细胞克隆形成数、G2/M期细胞数、凋亡相关酶Caspase-3/7活性、细胞凋亡率均无明显差异(P＞0.05)。与Dinaciclib处理组相比，SurvivinsiRNA组Survivin蛋白表达下降(P＜0.05)，细胞克隆形成数减少(P＜0.05)，细胞较多阻滞于G2/M期(P＜0.05)，凋亡相关酶Caspase-3/7活性增加(P＜0.05)，细胞凋亡率增加(P＜0.05)。与SurvivinsiRNA组相比，Dinaciclib+SurvivinsiRNA组Survivin蛋白表达下降(P＜0.05)，细胞克隆形成数减少(P＜0.05)，细胞较多阻滞于G2/M期(P＜0.05)，凋亡相关酶Caspase-3/7活性增加(P＜0.05)，细胞凋亡率增加(P＜0.05)。
小结：
1.CDK1与Survivin的表达增加可能为Raji/Dinaciclib耐药的原因，细胞周期相关通路可能与Raji/Dinaciclib耐药密切相关。
2.敲低Raji/Dinaciclib耐药细胞中CDK1或Survivin的表达，可以增加Dinaciclib的药物敏感性。
3.Dinaciclib可以部分通过作用于CDK1及Survivin而发挥抑制Burkitt淋巴瘤Raji细胞增殖以及促凋亡作用。
第三部分Dinaciclib对Raji细胞裸鼠移植瘤的抗肿瘤作用
方法：
1.在裸鼠的右腋下行皮下注射Raji细胞(2×106/小鼠)来建立小鼠异种移植瘤模型，实验组每隔一天根据体重腹腔内注射Dinaciclib(3mg/kg)，对照组给予生理盐水。每隔5天用游标卡尺测量瘤体大小并计算瘤体体积，在第25天处死小鼠并剥离瘤体，进行称重。
2.制作瘤体组织切片，行H&E染色及TUNEL实验，进一步采用免疫组化方法检测Ki-67的表达情况。
3.Westernblotting检测瘤体组织中CDK1、Survivin、p-mTOR、p21、Bcl-2、Bax蛋白的表达。
结果：
1.成功建立Raji细胞小鼠异种移植瘤模型，与对照组相比，Dinaciclib处理组瘤体体积减小(P＜0.05)，重量减轻(P＜0.05)。
2.与对照组相比，Dinaciclib组Ki-67阳性的细胞数减少(P＜0.05)，细胞凋亡率增加(P＜0.05)，CDK1、Survivin、p-mTOR和Bcl-2蛋白表达减少(P＜0.05)，p21、Bax蛋白表达升高(P＜0.05)。
小结：
1.Dinaciclib能够抑制裸鼠Raji细胞移植瘤的生长，同时能够抑制细胞增殖、促进凋亡。
2.Dinaciclib在裸鼠体内抗Raji细胞移植瘤效应部分通过作用于CDK1、Survivin、p-mTOR、Bcl-2、Bax、p21的表达来实现。
结论：
1.在Burkitt淋巴瘤Raji及Ramos细胞中，Dinaciclib能够有效地抑制细胞增殖、促进凋亡，并与顺铂有协同作用。
2.CDK1与Survivin的表达增加可能为Raji/Dinaciclib耐药的原因，敲低Raji/Dinaciclib耐药细胞中CDK1或Survivin的表达，可以增加Dinaciclib的药物敏感性，Dinaciclib部分通过作用于CDK1及Survivin而发挥抑制Raji细胞增殖以及促凋亡作用，CDK1与Survivin有可能成为Dinaciclib作用于Burkitt淋巴瘤的靶点之一。
3.Dinaciclib在体内对裸鼠Raji细胞移植瘤具有抗肿瘤作用。