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研究背景：
我国胃癌的发病率和死亡率居恶性肿瘤的第二位，远高于欧美国家。胃癌的总体发病人数约占世界的42%。目前胃癌的治疗方法包括手术、放疗、化疗和靶向治疗，虽然胃癌的综合治疗提高了HER-2阳性胃癌患者的生存时间但胃癌的遗传复杂性和异质性很大程度上影响了胃癌的疗效和预后。因此，进一步明确胃癌的复发转移以及HER2单抗耐药的机制，对早日找到新的胃癌治疗靶点从而攻克胃癌非常重要。
lncRNAHOTAIR在胃癌中过表达。它通过沉默PRC2介导的HOXD基因促进肿瘤转移和复发。研究表明，过表达HOTAIR的胃癌细胞具有较强的细胞增殖能力。相反，研究发现HOTAIR的缺失抑制胃癌细胞的侵袭。研究发现HOTAIR在胃癌组织中表达升高，并且与淋巴结转移显著以及预后差密切相关。
ERBB受体酪氨酸激酶(RTK)家族包括4个成员：EGFR(ERBB1/HER-1)，HER2(c-erb B-2/Neu)，ERBB3(HER-3)和ERBB4(HER-4)。研究表明只有HER2在胃癌中高表达。在临床实践中，HER2是目前唯一用于胃癌患者治疗靶点的HER家族成员。在ToGA临床研究中，针对HER2的单克隆抗体(曲妥珠单抗)联合化疗较传统的单用化疗，含抗HER2治疗的联合治疗可显著延长HER2阳性的晚期胃或胃食管交界部腺癌患者的总生存期(16个月vs11.2个月)。基于此项研究，曲妥珠单抗联合化疗成为HER2阳性胃或胃食管交界部腺癌患者的一线标准治疗。但是曲妥珠单抗和其他抗肿瘤药物一样，都存在原发和继发耐药问题，极大限制了它的疗效和应用；且其他的靶向HER2的药物临床试验均未取得阳性结果，HER2阳性胃癌患者在曲妥珠单抗治疗无效后，暂无其他的HER2靶向治疗策略可供选择。因此，探讨曲妥珠单抗耐药机制进而逆转其耐药具有十分迫切的临床意义。
在我们的前期临床实践中发现HOTAIR的高表达与曲妥珠单抗的耐药存在相关性，但是具体机制尚不明确。HOTAIR在胃癌发生发展的详细机制仍有很多未知。为此，我们将从ceRNA网络的角度结合生物信息学和细胞分子生物学方法去探索HOTAIR与曲妥珠单抗耐药的关系，并进一步以裸鼠荷瘤实验去验证我们的假设。本研究旨在探索曲妥珠单抗耐药的可能机制，为提高胃癌的靶向治疗疗效提供相应的理论基础。
第一部分：HOTAIR表达量与胃癌细胞曲妥珠单抗敏感性的关系
目的：
本部分实验主要是分析HOTAIR表达量与胃癌细胞曲妥珠单抗敏感性之间的关系。检测不同胃癌标本中HOTAIR的表达水平，以及不同HOTAIR表达水平的胃癌细胞对曲妥珠单抗的敏感性并分析其相关性。在TCGA数据库获得的胃癌数据分析对HOTAIR表达与生存率的关系进行分析。
方法：
收集临床胃癌病理标本，提取胃癌组织的总RNA。利用荧光定量PCR检测胃癌组织中HOTAIR的表达水平。对胃癌组织进行原代细胞分离并培养，利用CCK-8试剂盒检测胃癌细胞对曲妥珠单抗的敏感性。用流式细胞仪检测凋亡。收集TCGA数据库中的胃癌数据，分析HOTAIR表达量的高低与胃癌患者生存率的关系。利用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，log-rank检验生存率。
结果：
qRT-PCR结果显示，与癌旁组织相比，HOTAIR在胃癌组织中的表达显著升高。CCK-8检测显示，HOTAIR相对表达量与曲妥珠单抗胃癌细胞抑制率之间存在负相关性，即HOTAIR的相对表达水平越高，曲妥珠单抗的抑制率越低。生存曲线结果表明，HOTAIR表达量低的患者生存率整体高于HOTAIR高表达的患者。
小结：
HOTAIR的高表达与胃癌的发生发展及曲妥珠单抗耐药相关，且与胃癌患者的不良预后存在相关性。
第二部分：HOTAIR在胃癌细胞中的生物学功能研究
目的：
构建HOTAIR过表达慢病毒和沉默慢病毒载体；筛选过表达HOTAIR细胞株及沉默HOTAIR细胞株。检测HOTAIR对胃癌细胞生物学功能(包括细胞活力、细胞增殖、凋亡、侵袭等)的影响。分析过表达和沉默HOTAIR与胃癌细胞对曲妥珠单抗耐药的相关性。
方法：
利用荧光定量PCR检测并筛选过表达HOTAIR和沉默HOTAIR胃癌细胞株，CCK-8法检测HOTAIR对胃癌细胞活力的影响。EDU检测HOTAIR对胃癌细胞增殖的影响，Transwell实验检测HOTAIR对胃癌细胞侵袭的影响，流式细胞术检测HOTAIR对胃癌细胞凋亡的影响，CCK-8细胞活力检测试剂盒检测过表达、沉默HOTAIR胃癌细胞株对HER2抑制剂的敏感性。
结果
荧光定量PCR检测结果证实，成功构建了过表达和沉默HOTAIR胃癌细胞株。CCK-8细胞活力检测显示，过表达HOTAIR能够增加胃癌细胞的活力，沉默HOTAIR能够抑制胃癌细胞的活力。EDU检测结果表明，过表达HOTAIR可以促进胃癌细胞的增殖，沉默HOTAIR可以抑制胃癌细胞的增殖。细胞凋亡检测发现，沉默HOTAIR能够促进胃癌细胞的凋亡。Transwell实验结果表明，过表达HOTAIR能够显著促进胃癌细胞的侵袭能力，沉默HOTAIR能够显著抑制胃癌细胞的侵袭能力。CCK-8细胞活力检测过表达和沉默HOTAIR细胞株对曲妥珠单抗和阿法替尼的敏感性情况结果显示，过表达HOTAIR可以增加胃癌细胞对曲妥珠单抗和阿法替尼的耐药；与阿法替尼相比，过表达HOTAIR使胃癌细胞对曲妥珠单抗耐药的显著升高。在沉默HOTAIR后，可以降低胃癌细胞对曲妥珠单抗和阿法替尼的耐药，但曲妥珠单抗降低的幅度没有阿法替尼显著。
小结：
过表达HOTAIR导致胃癌细胞的增殖和侵袭能力的增加；沉默HOTAIR促使胃癌细胞的凋亡；过表达HOTAIR能够增加胃癌细胞对曲妥珠单抗的耐药。
第三部分：HOTAIR影响胃癌细胞HER2抑制剂敏感性的机制
目的
探讨HOTAIR是否可能作为一种ceRNA，调节与曲妥珠单抗耐药相关的基因；进而设计一系列实验来验证HOTAIR作为ERBB4ceRNA的可能性，并进一步阐释HOTAIR影响胃癌细胞曲妥珠单抗耐药的机制。最后，在动物体内验证HOTAIR表达量变化对移植瘤的影响，探讨过表达HOTAIR的胃癌细胞对不同HER2抑制剂的敏感性差异。
方法
利用生物信息学方法，寻找出HOTAIR可能的靶标miRNA:miR-330-5p。应用萤光素酶靶标实验，验证miR-330-5p与HOTAIR和ERBB4之间的关系；在过表达HOTAIR细胞株和正常细胞株中过表达miR-330-5p，荧光定量PCR检测HOTAIR、miR-330-5p、ERBB4的mRNA水平；Westernblot检测不同抑制剂干预下HER2、ERBB4表达量变化以及PI3K-Akt通路相关蛋白的磷酸化影响。建立裸鼠成瘤模型，检测裸鼠移植瘤对HER2抑制剂的敏感性，观察并记录移植瘤的体积和重量变化。
结果：
双萤光素酶报告基因检测验证，miR-330-5p能够与HOTAIR和ERBB4基因结合。qRT-PCR检测结果显示，过表达miR-330-5p可以抑制HOTAIR和ERBB4的表达，过表达HOTAIR可以促进ERBB4过表达；HOTAIR通过与miR-330-5p竞争性结合，缓解miRNA330-5p对ERBB4的抑制；沉默ERBB4能够逆转胃癌细胞因过表达HOTAIR而引起的曲妥珠单抗耐药。Westernblot检测结果显示，曲妥珠单抗对HER2、ERBB4、Akt及ERK1/2的总量及磷酸化水平无显著影响；HOTAIR表达量或阿法替尼对HER2的表达均无影响；过表达HOTAIR导致了ERBB4蛋白表达水平上升；ERBB4的表达量的增加对总的AKT和ERK1/2蛋白水平无显著影响，但是能够导致pAKT和pERK1/2的比例增加。对于HOTAIR高表达或ERBB4高表达的胃癌细胞，阿法替尼较曲妥珠单抗的肿瘤细胞抑制率高，是因为阿法替尼能够抑制ERBB4增加而引起的PI3K/Akt通路的磷酸化。裸鼠成瘤实验表明，过表达HOTAIR可以促进胃癌细胞移植瘤的增殖，曲妥珠单抗和阿法替尼都可以抑制移植瘤的增殖，阿法替尼相对显著，二者共同作用时效果更显著。
小结：
HOTAIR与miRNA-330存在靶向关系；ERBB4是miRNA-330的靶基因；HOTAIR是一种内源性竞争RNA(ceRNA)，可以竞争性结合miRNA-330，逆转miRNA330-5p对ERBB4的抑制；
HOTAIR使ERBB4水平增加，使下游PI3K-Akt通路蛋白磷酸化增加，导致胃癌细胞对曲妥珠单抗耐药；阿法替尼能够抑制PI3K-Akt通路蛋白磷酸化，逆转因ERBB4引起的曲妥珠单抗耐药。
HOTAIR过表达可以促进胃癌细胞移植瘤的增殖；阿法替尼对HOTAIR过表达移植瘤抑制率比曲妥珠单抗显著；二者共同作用时效果更显著。
结论：
HOTAIR的高表达与胃癌的发生发展及曲妥珠单抗耐药相关，且与胃癌患者的不良预后存在相关性。
过表达HOTAIR导致胃癌细胞的增殖和侵袭能力的增加；沉默HOTAIR促进胃癌细胞的凋亡；过表达HOTAIR增加了胃癌细胞对曲妥珠单抗的耐药。
HOTAIR是一种内源性竞争RNA(ceRNA)，可以竞争性结合miRNA-330，解除miRNA330-5p对ERBB4的抑制；HOTAIR使ERBB4水平增加，使下游PI3K-Akt通路蛋白磷酸化增加，从而导致胃癌细胞对曲妥珠单抗的耐药。
阿法替尼能够抑制PI3K-Akt通路蛋白磷酸化，从而逆转因ERBB4过表达引起的曲妥珠单抗耐药。
我国胃癌的发病率和死亡率居恶性肿瘤的第二位，远高于欧美国家。胃癌的总体发病人数约占世界的42%。目前胃癌的治疗方法包括手术、放疗、化疗和靶向治疗，虽然胃癌的综合治疗提高了HER-2阳性胃癌患者的生存时间但胃癌的遗传复杂性和异质性很大程度上影响了胃癌的疗效和预后。因此，进一步明确胃癌的复发转移以及HER2单抗耐药的机制，对早日找到新的胃癌治疗靶点从而攻克胃癌非常重要。
lncRNAHOTAIR在胃癌中过表达。它通过沉默PRC2介导的HOXD基因促进肿瘤转移和复发。研究表明，过表达HOTAIR的胃癌细胞具有较强的细胞增殖能力。相反，研究发现HOTAIR的缺失抑制胃癌细胞的侵袭。研究发现HOTAIR在胃癌组织中表达升高，并且与淋巴结转移显著以及预后差密切相关。
ERBB受体酪氨酸激酶(RTK)家族包括4个成员：EGFR(ERBB1/HER-1)，HER2(c-erb B-2/Neu)，ERBB3(HER-3)和ERBB4(HER-4)。研究表明只有HER2在胃癌中高表达。在临床实践中，HER2是目前唯一用于胃癌患者治疗靶点的HER家族成员。在ToGA临床研究中，针对HER2的单克隆抗体(曲妥珠单抗)联合化疗较传统的单用化疗，含抗HER2治疗的联合治疗可显著延长HER2阳性的晚期胃或胃食管交界部腺癌患者的总生存期(16个月vs11.2个月)。基于此项研究，曲妥珠单抗联合化疗成为HER2阳性胃或胃食管交界部腺癌患者的一线标准治疗。但是曲妥珠单抗和其他抗肿瘤药物一样，都存在原发和继发耐药问题，极大限制了它的疗效和应用；且其他的靶向HER2的药物临床试验均未取得阳性结果，HER2阳性胃癌患者在曲妥珠单抗治疗无效后，暂无其他的HER2靶向治疗策略可供选择。因此，探讨曲妥珠单抗耐药机制进而逆转其耐药具有十分迫切的临床意义。
在我们的前期临床实践中发现HOTAIR的高表达与曲妥珠单抗的耐药存在相关性，但是具体机制尚不明确。HOTAIR在胃癌发生发展的详细机制仍有很多未知。为此，我们将从ceRNA网络的角度结合生物信息学和细胞分子生物学方法去探索HOTAIR与曲妥珠单抗耐药的关系，并进一步以裸鼠荷瘤实验去验证我们的假设。本研究旨在探索曲妥珠单抗耐药的可能机制，为提高胃癌的靶向治疗疗效提供相应的理论基础。
第一部分：HOTAIR表达量与胃癌细胞曲妥珠单抗敏感性的关系
目的：
本部分实验主要是分析HOTAIR表达量与胃癌细胞曲妥珠单抗敏感性之间的关系。检测不同胃癌标本中HOTAIR的表达水平，以及不同HOTAIR表达水平的胃癌细胞对曲妥珠单抗的敏感性并分析其相关性。在TCGA数据库获得的胃癌数据分析对HOTAIR表达与生存率的关系进行分析。
方法：
收集临床胃癌病理标本，提取胃癌组织的总RNA。利用荧光定量PCR检测胃癌组织中HOTAIR的表达水平。对胃癌组织进行原代细胞分离并培养，利用CCK-8试剂盒检测胃癌细胞对曲妥珠单抗的敏感性。用流式细胞仪检测凋亡。收集TCGA数据库中的胃癌数据，分析HOTAIR表达量的高低与胃癌患者生存率的关系。利用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，log-rank检验生存率。
结果：
qRT-PCR结果显示，与癌旁组织相比，HOTAIR在胃癌组织中的表达显著升高。CCK-8检测显示，HOTAIR相对表达量与曲妥珠单抗胃癌细胞抑制率之间存在负相关性，即HOTAIR的相对表达水平越高，曲妥珠单抗的抑制率越低。生存曲线结果表明，HOTAIR表达量低的患者生存率整体高于HOTAIR高表达的患者。
小结：
HOTAIR的高表达与胃癌的发生发展及曲妥珠单抗耐药相关，且与胃癌患者的不良预后存在相关性。
第二部分：HOTAIR在胃癌细胞中的生物学功能研究
目的：
构建HOTAIR过表达慢病毒和沉默慢病毒载体；筛选过表达HOTAIR细胞株及沉默HOTAIR细胞株。检测HOTAIR对胃癌细胞生物学功能(包括细胞活力、细胞增殖、凋亡、侵袭等)的影响。分析过表达和沉默HOTAIR与胃癌细胞对曲妥珠单抗耐药的相关性。
方法：
利用荧光定量PCR检测并筛选过表达HOTAIR和沉默HOTAIR胃癌细胞株，CCK-8法检测HOTAIR对胃癌细胞活力的影响。EDU检测HOTAIR对胃癌细胞增殖的影响，Transwell实验检测HOTAIR对胃癌细胞侵袭的影响，流式细胞术检测HOTAIR对胃癌细胞凋亡的影响，CCK-8细胞活力检测试剂盒检测过表达、沉默HOTAIR胃癌细胞株对HER2抑制剂的敏感性。
结果
荧光定量PCR检测结果证实，成功构建了过表达和沉默HOTAIR胃癌细胞株。CCK-8细胞活力检测显示，过表达HOTAIR能够增加胃癌细胞的活力，沉默HOTAIR能够抑制胃癌细胞的活力。EDU检测结果表明，过表达HOTAIR可以促进胃癌细胞的增殖，沉默HOTAIR可以抑制胃癌细胞的增殖。细胞凋亡检测发现，沉默HOTAIR能够促进胃癌细胞的凋亡。Transwell实验结果表明，过表达HOTAIR能够显著促进胃癌细胞的侵袭能力，沉默HOTAIR能够显著抑制胃癌细胞的侵袭能力。CCK-8细胞活力检测过表达和沉默HOTAIR细胞株对曲妥珠单抗和阿法替尼的敏感性情况结果显示，过表达HOTAIR可以增加胃癌细胞对曲妥珠单抗和阿法替尼的耐药；与阿法替尼相比，过表达HOTAIR使胃癌细胞对曲妥珠单抗耐药的显著升高。在沉默HOTAIR后，可以降低胃癌细胞对曲妥珠单抗和阿法替尼的耐药，但曲妥珠单抗降低的幅度没有阿法替尼显著。
小结：
过表达HOTAIR导致胃癌细胞的增殖和侵袭能力的增加；沉默HOTAIR促使胃癌细胞的凋亡；过表达HOTAIR能够增加胃癌细胞对曲妥珠单抗的耐药。
第三部分：HOTAIR影响胃癌细胞HER2抑制剂敏感性的机制
目的
探讨HOTAIR是否可能作为一种ceRNA，调节与曲妥珠单抗耐药相关的基因；进而设计一系列实验来验证HOTAIR作为ERBB4ceRNA的可能性，并进一步阐释HOTAIR影响胃癌细胞曲妥珠单抗耐药的机制。最后，在动物体内验证HOTAIR表达量变化对移植瘤的影响，探讨过表达HOTAIR的胃癌细胞对不同HER2抑制剂的敏感性差异。
方法
利用生物信息学方法，寻找出HOTAIR可能的靶标miRNA:miR-330-5p。应用萤光素酶靶标实验，验证miR-330-5p与HOTAIR和ERBB4之间的关系；在过表达HOTAIR细胞株和正常细胞株中过表达miR-330-5p，荧光定量PCR检测HOTAIR、miR-330-5p、ERBB4的mRNA水平；Westernblot检测不同抑制剂干预下HER2、ERBB4表达量变化以及PI3K-Akt通路相关蛋白的磷酸化影响。建立裸鼠成瘤模型，检测裸鼠移植瘤对HER2抑制剂的敏感性，观察并记录移植瘤的体积和重量变化。
结果：
双萤光素酶报告基因检测验证，miR-330-5p能够与HOTAIR和ERBB4基因结合。qRT-PCR检测结果显示，过表达miR-330-5p可以抑制HOTAIR和ERBB4的表达，过表达HOTAIR可以促进ERBB4过表达；HOTAIR通过与miR-330-5p竞争性结合，缓解miRNA330-5p对ERBB4的抑制；沉默ERBB4能够逆转胃癌细胞因过表达HOTAIR而引起的曲妥珠单抗耐药。Westernblot检测结果显示，曲妥珠单抗对HER2、ERBB4、Akt及ERK1/2的总量及磷酸化水平无显著影响；HOTAIR表达量或阿法替尼对HER2的表达均无影响；过表达HOTAIR导致了ERBB4蛋白表达水平上升；ERBB4的表达量的增加对总的AKT和ERK1/2蛋白水平无显著影响，但是能够导致pAKT和pERK1/2的比例增加。对于HOTAIR高表达或ERBB4高表达的胃癌细胞，阿法替尼较曲妥珠单抗的肿瘤细胞抑制率高，是因为阿法替尼能够抑制ERBB4增加而引起的PI3K/Akt通路的磷酸化。裸鼠成瘤实验表明，过表达HOTAIR可以促进胃癌细胞移植瘤的增殖，曲妥珠单抗和阿法替尼都可以抑制移植瘤的增殖，阿法替尼相对显著，二者共同作用时效果更显著。
小结：
HOTAIR与miRNA-330存在靶向关系；ERBB4是miRNA-330的靶基因；HOTAIR是一种内源性竞争RNA(ceRNA)，可以竞争性结合miRNA-330，逆转miRNA330-5p对ERBB4的抑制；
HOTAIR使ERBB4水平增加，使下游PI3K-Akt通路蛋白磷酸化增加，导致胃癌细胞对曲妥珠单抗耐药；阿法替尼能够抑制PI3K-Akt通路蛋白磷酸化，逆转因ERBB4引起的曲妥珠单抗耐药。
HOTAIR过表达可以促进胃癌细胞移植瘤的增殖；阿法替尼对HOTAIR过表达移植瘤抑制率比曲妥珠单抗显著；二者共同作用时效果更显著。
结论：
HOTAIR的高表达与胃癌的发生发展及曲妥珠单抗耐药相关，且与胃癌患者的不良预后存在相关性。
过表达HOTAIR导致胃癌细胞的增殖和侵袭能力的增加；沉默HOTAIR促进胃癌细胞的凋亡；过表达HOTAIR增加了胃癌细胞对曲妥珠单抗的耐药。
HOTAIR是一种内源性竞争RNA(ceRNA)，可以竞争性结合miRNA-330，解除miRNA330-5p对ERBB4的抑制；HOTAIR使ERBB4水平增加，使下游PI3K-Akt通路蛋白磷酸化增加，从而导致胃癌细胞对曲妥珠单抗的耐药。
阿法替尼能够抑制PI3K-Akt通路蛋白磷酸化，从而逆转因ERBB4过表达引起的曲妥珠单抗耐药。