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肝细胞癌(hepatocel lular carcinoma，HCC)是发展中国家发病率最高的肿瘤，在全球肿瘤相关死因中位列第三。目前肝癌发病率在我国呈逐步上升趋势，其死亡率在我国占恶性肿瘤死亡的前列。肝细胞癌的发生与肝炎病毒感染的慢性肝脏疾病密切相关，通常发生在有肝纤维化的肝组织中。由于高敏感的肝癌诊断标志分子的缺乏和现有的诊疗技术的限制，肝癌患者诊断时多处于中晚期，其预后大多不良，这也给治疗带来更高的难度。如果能够在早期得到诊断，及时治疗，包括外科手术、肝移植、介入栓塞、射频等综合性治疗方法能取得相对较好的效果。目前临床上最常用的肝癌血清标记物是AFP，但是AFP诊断HCC有70％-80％的假阴性率，临床上仍有部分AFP阴性的HCC患者容易漏诊，因而AFP阴性HCC生物标记分子是目前研究重点。而近年来质谱技术，稳定同位素标记等高通量的蛋白质组学技术为蛋白质组的功能研究提供了新的技术平台。因而本研究利用同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)联合质谱技术(LC-MALDI-TOF/TOF)通过比较健康对照、乙型肝炎、肝纤维化、AFP阴性HCC人群的血清蛋白质，筛选和鉴定AFP阴性HCC患者血清差异表达蛋白，并进行验证，旨在对AFP阴性HCC的新的潜在标志物研究提供理论依据。
第一章 iTRAQ结合质谱筛选和鉴定AFP阴性HCC血清潜在标志物
目的：利用iTRAQ结合LC-MALDI-TOF/TOF比较健康对照、乙型肝炎、肝纤维化、AFP阴性HCC人群的血清蛋白的差异表达谱，寻找AFP阴性HCC的潜在血清标志物。
方法：收集性别、年龄匹配的健康对照、乙型肝炎、肝纤维化、AFP阴性HCC的各10例，每组血清样本混合后，经去高丰度蛋白、酶解、iTRAQ标记、SCX分镏和反向C18柱洗脱点靶，最后上5800-MALDI-TOF/TOF质谱仪进行MS/MS串联质谱检测。
结果：对健康对照、乙型肝炎、肝纤维化、AFP阴性HCC人群血清标记蛋白进行分析，共筛选和鉴定出14个明显表达差异蛋白;对14个差异表达蛋白进行蛋白相互作用的生物信息学分析，FN1、APOB、SERPIND1、C5、PPBP、APOA4、GSN、HRG、CRP、ITIH2等10个差异蛋白位于蛋白作用图节点位置。其中FN1（纤连蛋白1）质谱鉴定得分117，共鉴定出95％以上肽段66个，覆盖率达到37.3％，而且是10个差异蛋白中唯一114∶113，115∶113，116∶113的比值均呈现p＜0.05的差异蛋白;GSN质谱鉴定得分60.04，共鉴定出95％以上肽段45个，覆盖率达到53.8％，且是10个差异蛋白中116∶113最低值。
结论： iTRAQ结合LC-MALDI-TOF/TOF技术能够快速、有效地筛选和鉴定血清差异蛋白，在AFP阴性HCC患者血清中明显表达差异的蛋白FN1、GSN作为下一步研究的重点。
第二章 AFP阴性肝癌血清标记蛋白的验证
目的：对iTRAQ结合质谱筛选和鉴定的AFP阴性HCC患者血清潜在标志物FN1、GSN，以及本课题组前期SELDI-TOF/TOF筛选和鉴定的肝癌血清标志物NAP-2进行ELISA验证。
方法：性别、年龄匹配的健康对照者血清30例、肝炎患者30例、肝纤维化患者30例、未经抗肿瘤治疗AFP阴性HCC患者29例和经抗肿瘤治疗AFP阴性HCC患者血清30例。严格按照FN1、NAP-2、GSN(Human) ELISA Kit操作要求检测各组血清FN1、NAP-2和GSN的表达水平。
结果：在健康对照者、肝炎、肝纤维化、AFP阴性HCC患者血清中，ELISA检测FN1的表达水平分别为267.22±170.60μg/ml，202.54±156.25μg/ml，69.87±28.57μg/ml，122.20±70.15μg/ml，四组人群FN1差异有统计学意义(p＜0.005);ELISA检测GSN表达水平分别为54.14±32.02μg/ml，155.75±126.05μg/ml，152.88±98.23μg/ml，163.64±156.28μg/ml，四组人群GSN差异有统计学意义(p＜0.005);ELISA检测NAP-2表达水平分别为11.14±4.30μg/ml,6.95±4.52μg/ml,3.51±3.93μg/ml,5.70±4.17μg/ml，四组人群NAP-2差异有统计学意义(p＜0.005)。
结论： ELISA证实AFP阴性肝癌组血清中FN1、NAP-2蛋白表达均低于其在健康对照人群和肝炎患者血清中的表达，但明显高于肝纤维化组;GSN蛋白在肝炎、肝纤维化组、AFP阴性肝癌组血清中高于健康对照组，但肝炎、肝纤维化组和AFP阴性肝癌组GSN表达水平差异没有统计学意义。
第三章 FN1,NAP-2构建AFP阴性肝癌的筛查程序
目的:探讨联合AFP、FN1和NAP-2建立AFP阴性肝癌患者的筛选程序。
方法:性别、年龄匹配的健康对照者血清30例、肝纤维化患者30例、未经抗肿瘤治疗AFP阴性HCC患者29例和经抗肿瘤治疗AFP阴性HCC患者血清30例;各组血清FN1、NAP-2检测方法同第二章;采用SPSS13.0统计软件对FN1、NAP-2单项指标检测诊断AFP阴性肝癌的结果进行综合评价，并确定其最佳截断值;根据FN1和NAP-2最佳截断值联合AFP，构建两套AFP阴性肝癌患者的筛选程序。对健康对照者血清23例、肝炎患者22例、肝纤维化患者21例、AFP阴性HCC患者22例进行单盲实验，据实验结果确定AFP阴性肝癌患者的最佳筛选程序。
结果:以健康对照者为参照，单独检测FN1诊断AFP阴性肝癌的灵敏度为71.00％，特异度为83.00％，最佳截断值为143.09μg/ml;以肝纤维化患者为参照，单独检测NAP-2诊断AFP阴性肝癌的灵敏度为84.75％，特异度为70.00％，最佳截断值为2.69μg/ml。根据FN1和NAP-2最佳截断值联合AFP，构建两套AFP阴性肝癌患者的筛选程序。单盲法验证AFP阴性肝癌的筛选程序一，健康者的特异度为82.61％;肝纤维化患者的阳性率为71.42％;AFP性肝癌患者的阳性率为63.64％;准确度（符合率）为72.72％。单盲法验证AFP阴性肝癌的筛选程序二，健康者的特异度为91.30％;肝纤维化患者的阳性率为90.47％;AFP性肝癌患者的阳性率为45.46％;准确度为75.76％。程序一筛查AFP阴性肝癌患者的阳性率高于程序二，故确定程序一为AFP阴性肝癌患者的最佳筛选程序。
结论:联合B超检查，乙肝两对半、AFP、FN1和NAP-2检测，初步建立AFP阴性肝癌的筛选程序，为提高AFP阴性肝癌的检出率以及准确筛查肝癌高发区高危人群提供了新思路。
第一章 iTRAQ结合质谱筛选和鉴定AFP阴性HCC血清潜在标志物
目的：利用iTRAQ结合LC-MALDI-TOF/TOF比较健康对照、乙型肝炎、肝纤维化、AFP阴性HCC人群的血清蛋白的差异表达谱，寻找AFP阴性HCC的潜在血清标志物。
方法：收集性别、年龄匹配的健康对照、乙型肝炎、肝纤维化、AFP阴性HCC的各10例，每组血清样本混合后，经去高丰度蛋白、酶解、iTRAQ标记、SCX分镏和反向C18柱洗脱点靶，最后上5800-MALDI-TOF/TOF质谱仪进行MS/MS串联质谱检测。
结果：对健康对照、乙型肝炎、肝纤维化、AFP阴性HCC人群血清标记蛋白进行分析，共筛选和鉴定出14个明显表达差异蛋白;对14个差异表达蛋白进行蛋白相互作用的生物信息学分析，FN1、APOB、SERPIND1、C5、PPBP、APOA4、GSN、HRG、CRP、ITIH2等10个差异蛋白位于蛋白作用图节点位置。其中FN1（纤连蛋白1）质谱鉴定得分117，共鉴定出95％以上肽段66个，覆盖率达到37.3％，而且是10个差异蛋白中唯一114∶113，115∶113，116∶113的比值均呈现p＜0.05的差异蛋白;GSN质谱鉴定得分60.04，共鉴定出95％以上肽段45个，覆盖率达到53.8％，且是10个差异蛋白中116∶113最低值。
结论： iTRAQ结合LC-MALDI-TOF/TOF技术能够快速、有效地筛选和鉴定血清差异蛋白，在AFP阴性HCC患者血清中明显表达差异的蛋白FN1、GSN作为下一步研究的重点。
第二章 AFP阴性肝癌血清标记蛋白的验证
目的：对iTRAQ结合质谱筛选和鉴定的AFP阴性HCC患者血清潜在标志物FN1、GSN，以及本课题组前期SELDI-TOF/TOF筛选和鉴定的肝癌血清标志物NAP-2进行ELISA验证。
方法：性别、年龄匹配的健康对照者血清30例、肝炎患者30例、肝纤维化患者30例、未经抗肿瘤治疗AFP阴性HCC患者29例和经抗肿瘤治疗AFP阴性HCC患者血清30例。严格按照FN1、NAP-2、GSN(Human) ELISA Kit操作要求检测各组血清FN1、NAP-2和GSN的表达水平。
结果：在健康对照者、肝炎、肝纤维化、AFP阴性HCC患者血清中，ELISA检测FN1的表达水平分别为267.22±170.60μg/ml，202.54±156.25μg/ml，69.87±28.57μg/ml，122.20±70.15μg/ml，四组人群FN1差异有统计学意义(p＜0.005);ELISA检测GSN表达水平分别为54.14±32.02μg/ml，155.75±126.05μg/ml，152.88±98.23μg/ml，163.64±156.28μg/ml，四组人群GSN差异有统计学意义(p＜0.005);ELISA检测NAP-2表达水平分别为11.14±4.30μg/ml,6.95±4.52μg/ml,3.51±3.93μg/ml,5.70±4.17μg/ml，四组人群NAP-2差异有统计学意义(p＜0.005)。
结论： ELISA证实AFP阴性肝癌组血清中FN1、NAP-2蛋白表达均低于其在健康对照人群和肝炎患者血清中的表达，但明显高于肝纤维化组;GSN蛋白在肝炎、肝纤维化组、AFP阴性肝癌组血清中高于健康对照组，但肝炎、肝纤维化组和AFP阴性肝癌组GSN表达水平差异没有统计学意义。
第三章 FN1,NAP-2构建AFP阴性肝癌的筛查程序
目的:探讨联合AFP、FN1和NAP-2建立AFP阴性肝癌患者的筛选程序。
方法:性别、年龄匹配的健康对照者血清30例、肝纤维化患者30例、未经抗肿瘤治疗AFP阴性HCC患者29例和经抗肿瘤治疗AFP阴性HCC患者血清30例;各组血清FN1、NAP-2检测方法同第二章;采用SPSS13.0统计软件对FN1、NAP-2单项指标检测诊断AFP阴性肝癌的结果进行综合评价，并确定其最佳截断值;根据FN1和NAP-2最佳截断值联合AFP，构建两套AFP阴性肝癌患者的筛选程序。对健康对照者血清23例、肝炎患者22例、肝纤维化患者21例、AFP阴性HCC患者22例进行单盲实验，据实验结果确定AFP阴性肝癌患者的最佳筛选程序。
结果:以健康对照者为参照，单独检测FN1诊断AFP阴性肝癌的灵敏度为71.00％，特异度为83.00％，最佳截断值为143.09μg/ml;以肝纤维化患者为参照，单独检测NAP-2诊断AFP阴性肝癌的灵敏度为84.75％，特异度为70.00％，最佳截断值为2.69μg/ml。根据FN1和NAP-2最佳截断值联合AFP，构建两套AFP阴性肝癌患者的筛选程序。单盲法验证AFP阴性肝癌的筛选程序一，健康者的特异度为82.61％;肝纤维化患者的阳性率为71.42％;AFP性肝癌患者的阳性率为63.64％;准确度（符合率）为72.72％。单盲法验证AFP阴性肝癌的筛选程序二，健康者的特异度为91.30％;肝纤维化患者的阳性率为90.47％;AFP性肝癌患者的阳性率为45.46％;准确度为75.76％。程序一筛查AFP阴性肝癌患者的阳性率高于程序二，故确定程序一为AFP阴性肝癌患者的最佳筛选程序。
结论:联合B超检查，乙肝两对半、AFP、FN1和NAP-2检测，初步建立AFP阴性肝癌的筛选程序，为提高AFP阴性肝癌的检出率以及准确筛查肝癌高发区高危人群提供了新思路。