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精子发生是一个复杂的生理过程，这种独特的过程要求特定基因行使特定的调控作用。选择性剪接是指从一个mRNA前体中通过不同的剪接方式产生不同的mRNA剪接异构体的过程，而最终的蛋白产物会表现出不同结构和功能，从而在动物精子发生等生理过程中起到重要的调控作用。本研究通过对性成熟前后大白猪睾丸组织转录组测序，鉴定了差异表达基因，利用SOAPsplice和MISO软件分别对测序数据进行选择性剪接事件分析，筛选出差异表达的与精子发生相关的BCL2相关抗凋亡基因6(BCL2 associated athanogene 6，BAG6)的两个剪接体：全长剪接体(BAG6-FL)和24号外显子跳跃剪接体(BAG6-Δ24)，并对其在睾丸支持细胞中发挥的功能进行了研究。主要研究结果如下：
1、性成熟前后大白猪睾丸组织转录组测序及数据分析
(1)本研究选取60日龄和180日龄大白猪睾丸组织为试验材料进行转录组测序(华大基因公司完成)。以FDR≤0.001和|log2Ratio|≥1为基准，共检测到10095个差异表达的基因，其中5199个基因在180日龄中上调表达，4896个基因在60日龄中上调表达。利用qRT-PCR验证9个基因(PIWIL4、BAG6、DCTN、INHA、INHBA、SP1、TESK2、PRKAR1A和PRKACA)的差异表达，结果显示：除了DCTN，其他8个基因的表达模式与RNA-seq数据保持一致(皮尔森相关系数r为0.96，P值为3.31×10-5)。
(2)对差异表达基因的GO功能富集分析发现有5995个差异表达基因被显著富集到34个GO功能类别(P<0.05)，其中有242个差异表达基因被显著富集到精子发生过程(GO：0007283)，包括PIWIL家族(Piwi-like，PIWIL)、精子发生相关家族(spermatogenesis associated，SPATA)和BAG6等基因。对差异表达基因的KEGGpathway显著性富集分析发现有8657个差异表达基因注释到57个经典的KEGG信号通路中(P<0.05)，包括黏着斑通路(ko04510)、细胞外基质受体信号通路(ko04512)等。其中BAG6基因在肌动蛋白细胞骨架的调控(ko04810)和内质网中的蛋白加工(ko04141)等信号通路中显著富集。
(3)以参考基因组作为参照，分别在60日龄和180日龄大白猪睾丸组织中检测到了19996和15964个SNP。在242个精子发生相关的差异表达基因中，分别有106个基因的1224个SNP和174个基因的1622个SNP在60日龄和180日龄大白猪睾丸组织中被检测到。选取差异表达的PIWIL4基因的2个SNP位点进行PCR-RFLPs验证，发现PIWIL4基因g.572C>T位点和g.561G>A位点都与公猪精液品质性状间存在显著关联。
(4)利用SOAPsplice软件对60日龄和180日龄大白猪睾丸组织中的选择性剪接事件进行分析。结果显示：分别有7588个基因的30243个选择性剪接事件和7466个基因的29204个选择性剪接事件在60日龄和180日龄大白猪睾丸组织中被检测到。在60日龄大白猪中，内含子保留事件的比例最高；在180日龄大白猪中，外显子跳跃、内含子保留、可变的5’剪接位点和可变的3’剪接位点事件的比例都相对较高。
2、BAG6基因选择性剪接调控睾丸支持细胞的生长和血睾屏障的研究
(1)利用MISO软件筛选出差异表达的BAG6基因不同剪接体(|ΔPSI|≥10%)。通过qRT-PCR对BAG6基因不同剪接体进行验证，发现BAG6-FL剪接体在180日龄睾丸组织中高表达，而BAG6-Δ24剪接体在60日龄睾丸组织中高表达。通过免疫荧光检测BAG6不同剪接体在猪睾丸细胞(ST)中的亚细胞定位，发现两种剪接体都在细胞核和细胞质中表达，说明BAG6基因24号外显子跳跃对其亚细胞定位没有影响。
(2)通过MTT、流式细胞仪和Westernblot表明BAG6-FL剪接体可以促进ST细胞增殖、抑制ST细胞凋亡，而BAG6-Δ24剪接体可以抑制ST细胞增殖、促进ST细胞凋亡。Co-IP试验证明了BAG6-FL剪接体可以与热休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)和丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine kinase，RAF1)蛋白互作，而BAG6-Δ24剪接体由于24号外显子的缺失，导致其与HSP70和RAF1蛋白互作消失。在小鼠睾丸支持细胞中，通过免疫荧光发现BAG6-FL剪接体可以保持F-actin的束状结构，维持血睾屏障的完整性，而BAG6-Δ24剪接体导致F-actin排列紊乱，肌动蛋白丝被截短，血睾屏障完整性遭到破坏。
(3)qRT-PCR和Westernblot表明富含丝氨酸和精氨酸剪接因子1(serine and arginine rich splicing factor 1，SRSF1)通过其第二个RRM结构域来调控BAG6基因选择性剪接，进而下调BAG6-Δ24剪接体的表达。构建不同缺失片段的BAG6小基因真核表达载体，将其与SRSF1超表达载体共转，发现在BAG6外显子24上18bp-51bp位置处存在SRSF1的两个结合位点(35 bp-44 bp、45 bp-51 bp)，通过点突变证明了这两个结合位点对于SRSF1调控BAG6选择性剪接都是必需的。
(4)通过MTT、流式细胞仪和Westernblot表明SRSF1可以促进ST细胞增殖、抑制ST细胞凋亡。在小鼠睾丸支持细胞中，通过免疫荧光表明SRSF1可以保持F-actin的束状结构，维持血睾屏障的完整性。通过质粒共转表明SRSF1介导BAG6基因的选择性剪接，从而调控睾丸支持细胞的增殖、凋亡及维持血睾屏障的完整性。3、BAG6基因24号外显子敲除小鼠精子发生受损
(1)通过CRISPR/Cas9技术成功构建了BAG6基因24号外显子敲除小鼠模型，对其生殖器官进行称量发现：与野生型小鼠相比，8周龄BAG6exon24-/-小鼠睾丸和精囊腺重量显著下降(P<0.01)，而附睾重量没有显著变化。通过H&E染色发现：与野生型小鼠相比，在8周龄BAG6exon24-/-小鼠睾丸和附睾组织中都观察到大量脱落的生殖细胞，部分长形精子细胞的极性发生了变化，朝管底的方向移动。通过Giemsa染色对其精子形态进行观察，发现BAG6exon24-/-小鼠精子的头部、颈部和中段出现大量的异常，且精子畸形率高达75.5%。BAG6exon24-/-小鼠产仔数显著下降。通过ELISA发现：与野生型小鼠相比，8周龄BAG6exon24-/-小鼠血清中睾酮含量显著上升(P<0.001)，而FSH和LH的含量没有显著变化，激素水平发生异常。以上结果表明BAG6exon24-/-小鼠精子发生受阻，生育能力下降。
(2 )对8周龄BAG6exon24+/+和BAG6exon24-/-小鼠进行蛋白组测序发现，在BAG6exon24-/-小鼠中有96个蛋白上调表达，31个蛋白下调表达。下调表达的蛋白显著富集到精子鞭毛“9+2”结构等细胞组分、HSP70蛋白绑定等分子功能及程序化细胞死亡等生物过程中。通过透射电镜对精子鞭毛超微结构进行观察，发现BAG6exon24-/-小鼠精子尾部中段的外周致密纤维发生了缺失。
(3)通过Westernblot和TUNEL染色发现：与野生型小鼠相比，4周龄和8周龄BAG6exon24-/-小鼠BAX表达量显著升高(P<0.05)，睾丸曲细精管中TUNEL阳性的曲细精管数量显著升高(P<0.05)，并且TUNEL阳性的曲细精管中TUNEL阳性的细胞数量也显著升高(P<0.01)。
(4)通过Westernblot和免疫荧光发现：与野生型小鼠相比，4周龄和8周龄BAG6exon24-/-小鼠睾丸组织中血睾屏障相关蛋白除了OCLN之外，ZO-1、N-cadherin和β-catenin的表达量都显著下降(P<0.05)，同时这4种蛋白的定位也发生了变化，在整个曲细精管中散乱表达；8周龄BAG6exon24-/-小鼠睾丸组织中细胞骨架蛋白α-tubulin和F-actin表达杂乱无章；通过qRT-PCR发现：与野生型小鼠相比，BAG6exon24-/-小鼠睾丸组织中睾丸支持细胞相关基因AMH、AR、SOX9和GDNF的mRNA水平都显著下降(P<0.05，P<0.01)。以上结果表明BAG6exon24-/-小鼠血睾屏障受损。
1、性成熟前后大白猪睾丸组织转录组测序及数据分析
(1)本研究选取60日龄和180日龄大白猪睾丸组织为试验材料进行转录组测序(华大基因公司完成)。以FDR≤0.001和|log2Ratio|≥1为基准，共检测到10095个差异表达的基因，其中5199个基因在180日龄中上调表达，4896个基因在60日龄中上调表达。利用qRT-PCR验证9个基因(PIWIL4、BAG6、DCTN、INHA、INHBA、SP1、TESK2、PRKAR1A和PRKACA)的差异表达，结果显示：除了DCTN，其他8个基因的表达模式与RNA-seq数据保持一致(皮尔森相关系数r为0.96，P值为3.31×10-5)。
(2)对差异表达基因的GO功能富集分析发现有5995个差异表达基因被显著富集到34个GO功能类别(P<0.05)，其中有242个差异表达基因被显著富集到精子发生过程(GO：0007283)，包括PIWIL家族(Piwi-like，PIWIL)、精子发生相关家族(spermatogenesis associated，SPATA)和BAG6等基因。对差异表达基因的KEGGpathway显著性富集分析发现有8657个差异表达基因注释到57个经典的KEGG信号通路中(P<0.05)，包括黏着斑通路(ko04510)、细胞外基质受体信号通路(ko04512)等。其中BAG6基因在肌动蛋白细胞骨架的调控(ko04810)和内质网中的蛋白加工(ko04141)等信号通路中显著富集。
(3)以参考基因组作为参照，分别在60日龄和180日龄大白猪睾丸组织中检测到了19996和15964个SNP。在242个精子发生相关的差异表达基因中，分别有106个基因的1224个SNP和174个基因的1622个SNP在60日龄和180日龄大白猪睾丸组织中被检测到。选取差异表达的PIWIL4基因的2个SNP位点进行PCR-RFLPs验证，发现PIWIL4基因g.572C>T位点和g.561G>A位点都与公猪精液品质性状间存在显著关联。
(4)利用SOAPsplice软件对60日龄和180日龄大白猪睾丸组织中的选择性剪接事件进行分析。结果显示：分别有7588个基因的30243个选择性剪接事件和7466个基因的29204个选择性剪接事件在60日龄和180日龄大白猪睾丸组织中被检测到。在60日龄大白猪中，内含子保留事件的比例最高；在180日龄大白猪中，外显子跳跃、内含子保留、可变的5’剪接位点和可变的3’剪接位点事件的比例都相对较高。
2、BAG6基因选择性剪接调控睾丸支持细胞的生长和血睾屏障的研究
(1)利用MISO软件筛选出差异表达的BAG6基因不同剪接体(|ΔPSI|≥10%)。通过qRT-PCR对BAG6基因不同剪接体进行验证，发现BAG6-FL剪接体在180日龄睾丸组织中高表达，而BAG6-Δ24剪接体在60日龄睾丸组织中高表达。通过免疫荧光检测BAG6不同剪接体在猪睾丸细胞(ST)中的亚细胞定位，发现两种剪接体都在细胞核和细胞质中表达，说明BAG6基因24号外显子跳跃对其亚细胞定位没有影响。
(2)通过MTT、流式细胞仪和Westernblot表明BAG6-FL剪接体可以促进ST细胞增殖、抑制ST细胞凋亡，而BAG6-Δ24剪接体可以抑制ST细胞增殖、促进ST细胞凋亡。Co-IP试验证明了BAG6-FL剪接体可以与热休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)和丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine kinase，RAF1)蛋白互作，而BAG6-Δ24剪接体由于24号外显子的缺失，导致其与HSP70和RAF1蛋白互作消失。在小鼠睾丸支持细胞中，通过免疫荧光发现BAG6-FL剪接体可以保持F-actin的束状结构，维持血睾屏障的完整性，而BAG6-Δ24剪接体导致F-actin排列紊乱，肌动蛋白丝被截短，血睾屏障完整性遭到破坏。
(3)qRT-PCR和Westernblot表明富含丝氨酸和精氨酸剪接因子1(serine and arginine rich splicing factor 1，SRSF1)通过其第二个RRM结构域来调控BAG6基因选择性剪接，进而下调BAG6-Δ24剪接体的表达。构建不同缺失片段的BAG6小基因真核表达载体，将其与SRSF1超表达载体共转，发现在BAG6外显子24上18bp-51bp位置处存在SRSF1的两个结合位点(35 bp-44 bp、45 bp-51 bp)，通过点突变证明了这两个结合位点对于SRSF1调控BAG6选择性剪接都是必需的。
(4)通过MTT、流式细胞仪和Westernblot表明SRSF1可以促进ST细胞增殖、抑制ST细胞凋亡。在小鼠睾丸支持细胞中，通过免疫荧光表明SRSF1可以保持F-actin的束状结构，维持血睾屏障的完整性。通过质粒共转表明SRSF1介导BAG6基因的选择性剪接，从而调控睾丸支持细胞的增殖、凋亡及维持血睾屏障的完整性。3、BAG6基因24号外显子敲除小鼠精子发生受损
(1)通过CRISPR/Cas9技术成功构建了BAG6基因24号外显子敲除小鼠模型，对其生殖器官进行称量发现：与野生型小鼠相比，8周龄BAG6exon24-/-小鼠睾丸和精囊腺重量显著下降(P<0.01)，而附睾重量没有显著变化。通过H&E染色发现：与野生型小鼠相比，在8周龄BAG6exon24-/-小鼠睾丸和附睾组织中都观察到大量脱落的生殖细胞，部分长形精子细胞的极性发生了变化，朝管底的方向移动。通过Giemsa染色对其精子形态进行观察，发现BAG6exon24-/-小鼠精子的头部、颈部和中段出现大量的异常，且精子畸形率高达75.5%。BAG6exon24-/-小鼠产仔数显著下降。通过ELISA发现：与野生型小鼠相比，8周龄BAG6exon24-/-小鼠血清中睾酮含量显著上升(P<0.001)，而FSH和LH的含量没有显著变化，激素水平发生异常。以上结果表明BAG6exon24-/-小鼠精子发生受阻，生育能力下降。
(2 )对8周龄BAG6exon24+/+和BAG6exon24-/-小鼠进行蛋白组测序发现，在BAG6exon24-/-小鼠中有96个蛋白上调表达，31个蛋白下调表达。下调表达的蛋白显著富集到精子鞭毛“9+2”结构等细胞组分、HSP70蛋白绑定等分子功能及程序化细胞死亡等生物过程中。通过透射电镜对精子鞭毛超微结构进行观察，发现BAG6exon24-/-小鼠精子尾部中段的外周致密纤维发生了缺失。
(3)通过Westernblot和TUNEL染色发现：与野生型小鼠相比，4周龄和8周龄BAG6exon24-/-小鼠BAX表达量显著升高(P<0.05)，睾丸曲细精管中TUNEL阳性的曲细精管数量显著升高(P<0.05)，并且TUNEL阳性的曲细精管中TUNEL阳性的细胞数量也显著升高(P<0.01)。
(4)通过Westernblot和免疫荧光发现：与野生型小鼠相比，4周龄和8周龄BAG6exon24-/-小鼠睾丸组织中血睾屏障相关蛋白除了OCLN之外，ZO-1、N-cadherin和β-catenin的表达量都显著下降(P<0.05)，同时这4种蛋白的定位也发生了变化，在整个曲细精管中散乱表达；8周龄BAG6exon24-/-小鼠睾丸组织中细胞骨架蛋白α-tubulin和F-actin表达杂乱无章；通过qRT-PCR发现：与野生型小鼠相比，BAG6exon24-/-小鼠睾丸组织中睾丸支持细胞相关基因AMH、AR、SOX9和GDNF的mRNA水平都显著下降(P<0.05，P<0.01)。以上结果表明BAG6exon24-/-小鼠血睾屏障受损。