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毛色是家畜重要的质量性状之一，与MC1R基因调控黑色素的合成相关。家兔作为毛用、皮用和实验动物，其毛皮颜色与其经济价值密切相关。为此，本研究应用CRISPR/Cas9基因编辑技术，对敲除家兔MC1R基因获得新毛色家兔的可行性进行了探讨，研究主要取得如下结果：
1、兔MC1R基因编码区的克隆与分析
本研究对莲山黑兔、福建黄兔、新西兰大白兔、巨灰兔和巨型格仔兔的MC1R基因完整CDS区进行了PCR扩增，测序结果显示扩增片段与GenBank上发布的兔MC1R的CDS序列一致。随后对上述CDS序列进行了生物信息学分析：不同毛色兔MC1R基因的多重序列比对结果显示巨灰兔没有缺失突变，等位基因属于野生型E；莲山黑兔、新西兰大白兔和巨型格仔兔存在c.281_286del缺失，等位基因属于黑色显性上位型ED；福建黄兔存在c.304_333del缺失，等位基因属于隐性黄/红色型e。
2、CRSIPR/Cas9介导的MC1R基因敲除效率检测
本研究根据莲山黑兔MC1R基因CDS区的测序结果和蛋白质结构预测，在第二和第五个跨膜结构域上设计了两条sgRNA靶序列，成功构建了CRISPR/Cas9相关表达载体。随后在293T细胞中应用RGS荧光报告系统分别对两条sgRNA的靶向活性进行了初步检测，细胞流式检测结果显示两条sgRNA对的RGS质粒的靶向敲除效率分别为67.3%和76.1%。将表达两条sgRNA的质粒和Cas9质粒通过电转染的方法共转到兔胚胎成纤维细胞内，通过PCR扩增试验和测序证明两条sgRNA均可实现MC1R基因的长片段删除。在兔的受精卵中检测了同时注射两条sgRNA和注射单条sgRNA的敲除效率，PCR扩增和T7E1酶切结果表明，在受精卵中同时注射两条sgRNA的敲除效率达到85.7%，高于注射注射单条sgRNA的57.1%。上述结果证明本研究设计的两条sgRNA靶序列具有较高活性，可以通过在受精卵中共同注射两条sgRNA的策略高效地产生兔MC1R基因大片段删除。
3、MC1R敲除兔的生产与新毛色形成机制的研究
本研究利用验证了活性的两条sgRNA进行MC1R基因敲除兔的制备。将58枚注射了两条sgRNA和Cas9mRNA的莲山黑兔胚胎自体移植到4只莲山黑兔母兔后，2只母兔成功怀孕并最终产下9只后代。经PCR扩增和测序验证，上述后代中2只（编号Y31和Y32）为MC1R基因敲除阳性兔，其中Y32包含4种MC1R基因编辑类型，Y31包含2种基因编辑类型和野生型等位基因e。Y31和Y32均呈现比ee野生型黄色兔更浅的黄色，但Y31的毛色略深于Y32。H&E染色和光密度值分析结果表明MC1R基因敲除兔毛囊中真黑色素含量显著低于野生型黑色兔。阳性敲除兔MC1R蛋白结构预测结果表明，MC1R基因敲除兔中的各种基因编辑类型均可造成长片段删除或移码突变引起的终止密码子提前出现，造成MC1R蛋白的截短和结构的严重破坏。脱靶试验检测结果显示16个潜在脱靶位点中均不存在脱靶效应。荧光定量PCR检测结果显示，与野生型黄色兔相比，MC1R基因敲除兔中调控真黑色素合成的TYRP1和DCT基因的表达量显著下降。
上述研究结果表明，莲山黑兔受精卵中同时注射两条sgRNA和Cas9mRNA可以高效率删除MC1R基因的长片段，导致调控真黑色素合成的TYRP1和DCT基因表达降低，从而出现浅黄色的皮毛。
1、兔MC1R基因编码区的克隆与分析
本研究对莲山黑兔、福建黄兔、新西兰大白兔、巨灰兔和巨型格仔兔的MC1R基因完整CDS区进行了PCR扩增，测序结果显示扩增片段与GenBank上发布的兔MC1R的CDS序列一致。随后对上述CDS序列进行了生物信息学分析：不同毛色兔MC1R基因的多重序列比对结果显示巨灰兔没有缺失突变，等位基因属于野生型E；莲山黑兔、新西兰大白兔和巨型格仔兔存在c.281_286del缺失，等位基因属于黑色显性上位型ED；福建黄兔存在c.304_333del缺失，等位基因属于隐性黄/红色型e。
2、CRSIPR/Cas9介导的MC1R基因敲除效率检测
本研究根据莲山黑兔MC1R基因CDS区的测序结果和蛋白质结构预测，在第二和第五个跨膜结构域上设计了两条sgRNA靶序列，成功构建了CRISPR/Cas9相关表达载体。随后在293T细胞中应用RGS荧光报告系统分别对两条sgRNA的靶向活性进行了初步检测，细胞流式检测结果显示两条sgRNA对的RGS质粒的靶向敲除效率分别为67.3%和76.1%。将表达两条sgRNA的质粒和Cas9质粒通过电转染的方法共转到兔胚胎成纤维细胞内，通过PCR扩增试验和测序证明两条sgRNA均可实现MC1R基因的长片段删除。在兔的受精卵中检测了同时注射两条sgRNA和注射单条sgRNA的敲除效率，PCR扩增和T7E1酶切结果表明，在受精卵中同时注射两条sgRNA的敲除效率达到85.7%，高于注射注射单条sgRNA的57.1%。上述结果证明本研究设计的两条sgRNA靶序列具有较高活性，可以通过在受精卵中共同注射两条sgRNA的策略高效地产生兔MC1R基因大片段删除。
3、MC1R敲除兔的生产与新毛色形成机制的研究
本研究利用验证了活性的两条sgRNA进行MC1R基因敲除兔的制备。将58枚注射了两条sgRNA和Cas9mRNA的莲山黑兔胚胎自体移植到4只莲山黑兔母兔后，2只母兔成功怀孕并最终产下9只后代。经PCR扩增和测序验证，上述后代中2只（编号Y31和Y32）为MC1R基因敲除阳性兔，其中Y32包含4种MC1R基因编辑类型，Y31包含2种基因编辑类型和野生型等位基因e。Y31和Y32均呈现比ee野生型黄色兔更浅的黄色，但Y31的毛色略深于Y32。H&E染色和光密度值分析结果表明MC1R基因敲除兔毛囊中真黑色素含量显著低于野生型黑色兔。阳性敲除兔MC1R蛋白结构预测结果表明，MC1R基因敲除兔中的各种基因编辑类型均可造成长片段删除或移码突变引起的终止密码子提前出现，造成MC1R蛋白的截短和结构的严重破坏。脱靶试验检测结果显示16个潜在脱靶位点中均不存在脱靶效应。荧光定量PCR检测结果显示，与野生型黄色兔相比，MC1R基因敲除兔中调控真黑色素合成的TYRP1和DCT基因的表达量显著下降。
上述研究结果表明，莲山黑兔受精卵中同时注射两条sgRNA和Cas9mRNA可以高效率删除MC1R基因的长片段，导致调控真黑色素合成的TYRP1和DCT基因表达降低，从而出现浅黄色的皮毛。