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同期发情是应用外源性激素等方法改变一群母畜的发情周期，使其在一定时间内集中发情并排卵的技术。为加快优良家畜的高效繁育、提高生产效率、增加经济效益，大规模集约化养殖场往往在每个繁殖年度对适配母畜进行同期发情处理，导致母畜在繁殖年限中接受多次重复的同期发情处理。研究表明，重复激素刺激易引发副作用，导致动物繁殖性能下降，但具体分子机制尚不明确。本研究使用PMSG和FSH两种不同的同期发情方案，将96只西农萨能羊分为4组，每组24只，分别为接受1次或重复3次PMSG同期发情处理的1-PMSG组与3-PMSG组；以及接受1次或重复3次FSH同期发情处理的1-FSH组与3-FSH组。本研究通过探讨重复PMSG或FSH同期发情处理对奶山羊繁殖性能、生长发育、泌乳性能、血液激素与生化指标含量、卵巢形态、卵巢组织mRNA和蛋白表达量等指标的影响，筛选影响繁殖性能的关键基因并在细胞水平上进行验证，探讨重复同期发情处理影响奶山羊繁殖性能的具体分子机制，获得如下结果：
1.重复同期发情处理对奶山羊生产性能的影响
重复PMSG同期发情处理显著降低奶山羊的发情率、受胎率和产羔率(P＜0.05)。重复FSH同期发情处理显著降低奶山羊的发情率与产羔率(P＜0.05)。重复PMSG或FSH同期发情处理对母羊所分娩的羔羊体况无显著影响，亦不影响奶山羊的泌乳性能、生长发育和血液生化指标含量。
2.重复同期发情处理对奶山羊激素水平的影响
重复PMSG同期发情处理导致撤拴后36、48、72h的雌激素含量、放栓时的孕激素以及撤栓后24、48、72hPMSG抗体含量显著升高(P＜0.05)。重复FSH同期发情处理亦可导致撤栓后24、36、60h雌激素含量上调，影响放栓过程中孕激素的含量，上调撤栓后36h的GH含量(P＜0.05)。3-FSH组FSH抗体的含量在撤栓后的24、48h均显著高于1-FSH组(P＜0.05)。重复FSH或PMSG同期发情处理均不影响机体FSH、LH、GnRH、MT、P4抗体的含量，亦不影响怀孕羊只妊娠阶段各种激素与激素抗体的含量。
3.重复同期发情处理对奶山羊卵巢形态的影响
在母羊撤栓后，从1-PMSG组、3-PMSG组、1-FSH组、3-FSH组各选取3只发情初期母羊进行活体单侧卵巢采集，在采样时对卵巢的尺寸及表面卵泡形态进行统计；将采集到的卵巢纵切为两部分，一部分用于RNA和蛋白的提取，另一部分石蜡包埋，用于卵巢组织切片的HE染色。结果表明，重复同期发情处理不影响奶山羊两侧卵巢的尺寸、卵巢皮质层不同直径的卵泡数目。1-PMSG组与3-PMSG组之间，1-FSH组和3-FSH之间卵巢组织切片中原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、囊状卵泡的形态均无显著差异。
4.重复同期发情处理奶山羊卵巢组织的转录组测序及分析
转录组测序结果显示，重复PMSG同期发情处理引起卵巢组织114个基因表达量发生变化。3-FSH组与1-FSH组相比，319个基因表达量发生显著变化(P＜0.05)。结合RT-qPCR、WB、免疫组化技术对差异基因进行验证，结果表明，与1-PMSG组相比，3-PMSG组中GCG基因mRNA与蛋白含量均显著上调(P＜0.05)。与1-FSH组相比，3-FSH组GH、PTGIS、DRD1基因mRNA与蛋白表达量均显著上升；ESR1与DHB1基因mRNA与蛋白表达量均显著下降(P＜0.05)。1-PMSG组、3-PMSG组、1-FSH组、3-FSH组存在4个共同的差异基因AQP3、SPIB、KIF26B与Novel00378。与1-PMSG组和1-FSH组相比，3-PMSG组与3-FSH组奶山羊卵巢组织中AQP3基因mRNA与蛋白表达水平均显著上调(P＜0.05)。
5.AQP3基因在奶山羊卵巢颗粒细胞与卵母细胞中的功能研究
过表达AQP3可导致卵巢颗粒细胞凋亡相关基因BCL-2表达量下降，Caspase3和Caspase9表达量上升(P＜0.01)；显著降低无血清培养后12、24、36h的孕激素，36h雌激素的分泌量(P＜0.05)。过表达AQP3基因显著降低卵母细胞的成熟率、孤雌激活后的卵裂率与体外受精后的卵裂率(P＜0.05)。
综上所述，重复PMSG或FSH同期发情处理降低了奶山羊的繁殖性能；促使PMSG抗体、FSH抗体在血浆中显著升高，并影响了母羊体内孕激素、雌激素的含量；导致卵巢组织基因与蛋白表达量的变化，其中AQP3基因mRNA与蛋白表达量均明显上升。AQP3基因在卵巢颗粒细胞与卵母细胞中的过表达，可导致卵巢颗粒细胞的凋亡与性腺激素分泌水平的降低，以及卵母细胞生长发育和生殖性能的损伤，揭示AQP3是重复同期发情处理导致奶山羊繁殖性能降低的关键基因。本研究进一步阐释了重复同期发情处理降低奶山羊繁殖性能的分子机制，为优化同期发情技术在畜牧业中的应用提供了理论依据，为奶山羊产业的快速发展奠定基础。
1.重复同期发情处理对奶山羊生产性能的影响
重复PMSG同期发情处理显著降低奶山羊的发情率、受胎率和产羔率(P＜0.05)。重复FSH同期发情处理显著降低奶山羊的发情率与产羔率(P＜0.05)。重复PMSG或FSH同期发情处理对母羊所分娩的羔羊体况无显著影响，亦不影响奶山羊的泌乳性能、生长发育和血液生化指标含量。
2.重复同期发情处理对奶山羊激素水平的影响
重复PMSG同期发情处理导致撤拴后36、48、72h的雌激素含量、放栓时的孕激素以及撤栓后24、48、72hPMSG抗体含量显著升高(P＜0.05)。重复FSH同期发情处理亦可导致撤栓后24、36、60h雌激素含量上调，影响放栓过程中孕激素的含量，上调撤栓后36h的GH含量(P＜0.05)。3-FSH组FSH抗体的含量在撤栓后的24、48h均显著高于1-FSH组(P＜0.05)。重复FSH或PMSG同期发情处理均不影响机体FSH、LH、GnRH、MT、P4抗体的含量，亦不影响怀孕羊只妊娠阶段各种激素与激素抗体的含量。
3.重复同期发情处理对奶山羊卵巢形态的影响
在母羊撤栓后，从1-PMSG组、3-PMSG组、1-FSH组、3-FSH组各选取3只发情初期母羊进行活体单侧卵巢采集，在采样时对卵巢的尺寸及表面卵泡形态进行统计；将采集到的卵巢纵切为两部分，一部分用于RNA和蛋白的提取，另一部分石蜡包埋，用于卵巢组织切片的HE染色。结果表明，重复同期发情处理不影响奶山羊两侧卵巢的尺寸、卵巢皮质层不同直径的卵泡数目。1-PMSG组与3-PMSG组之间，1-FSH组和3-FSH之间卵巢组织切片中原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、囊状卵泡的形态均无显著差异。
4.重复同期发情处理奶山羊卵巢组织的转录组测序及分析
转录组测序结果显示，重复PMSG同期发情处理引起卵巢组织114个基因表达量发生变化。3-FSH组与1-FSH组相比，319个基因表达量发生显著变化(P＜0.05)。结合RT-qPCR、WB、免疫组化技术对差异基因进行验证，结果表明，与1-PMSG组相比，3-PMSG组中GCG基因mRNA与蛋白含量均显著上调(P＜0.05)。与1-FSH组相比，3-FSH组GH、PTGIS、DRD1基因mRNA与蛋白表达量均显著上升；ESR1与DHB1基因mRNA与蛋白表达量均显著下降(P＜0.05)。1-PMSG组、3-PMSG组、1-FSH组、3-FSH组存在4个共同的差异基因AQP3、SPIB、KIF26B与Novel00378。与1-PMSG组和1-FSH组相比，3-PMSG组与3-FSH组奶山羊卵巢组织中AQP3基因mRNA与蛋白表达水平均显著上调(P＜0.05)。
5.AQP3基因在奶山羊卵巢颗粒细胞与卵母细胞中的功能研究
过表达AQP3可导致卵巢颗粒细胞凋亡相关基因BCL-2表达量下降，Caspase3和Caspase9表达量上升(P＜0.01)；显著降低无血清培养后12、24、36h的孕激素，36h雌激素的分泌量(P＜0.05)。过表达AQP3基因显著降低卵母细胞的成熟率、孤雌激活后的卵裂率与体外受精后的卵裂率(P＜0.05)。
综上所述，重复PMSG或FSH同期发情处理降低了奶山羊的繁殖性能；促使PMSG抗体、FSH抗体在血浆中显著升高，并影响了母羊体内孕激素、雌激素的含量；导致卵巢组织基因与蛋白表达量的变化，其中AQP3基因mRNA与蛋白表达量均明显上升。AQP3基因在卵巢颗粒细胞与卵母细胞中的过表达，可导致卵巢颗粒细胞的凋亡与性腺激素分泌水平的降低，以及卵母细胞生长发育和生殖性能的损伤，揭示AQP3是重复同期发情处理导致奶山羊繁殖性能降低的关键基因。本研究进一步阐释了重复同期发情处理降低奶山羊繁殖性能的分子机制，为优化同期发情技术在畜牧业中的应用提供了理论依据，为奶山羊产业的快速发展奠定基础。