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弥漫性胶质瘤（diffuse gliomas）包括星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、少突星形细胞瘤和胶质母细胞瘤等亚型，是中枢神经系统（CNS）最常见的原发性脑肿瘤。常规的治疗方法包括神经外科手术切除、放射治疗并辅助化学药物治疗；其中，替莫唑胺（TMZ）是脑部肿瘤，如胶质母细胞瘤的一线治疗药物。长链非编码 RNA（lncRNA）在各种疾病和细胞模型中起着重要作用，例如在癌症中，它们可能作为肿瘤抑制因子或原癌基因。其中，长基因间非蛋白编码RNA（lincRNA）是长链非编码 RNAs 的主要亚型，lincRNA 位于两编码基因之间的基因组区间内。某些lincRNAs可以作为竞争性内源RNA（ceRNA），在细胞质中通过“海绵”作用吸附microRNA来调节其相应靶基因的表达水平与生物学效应。大量研究表明lincRNA在细胞生物学功能与表观遗传学调控等众多生命活动中发挥着越来越重要的作用，已成为生命科学研究的热点。
在本研究中，通过对GEO胶质瘤数据集GSE4290的生物信息学分析，鉴定筛选出了在弥漫性胶质瘤中差异表达的lincRNAs，如：PVT1、HAR1A、LINC01094与MIAT。与非肿瘤对照组相比LINC01094与PVT1在弥漫性胶质瘤中的表达均明显上调，而HAR1A和MIAT在胶质瘤中均显著低表达；这四个异常表达的lincRNAs与胶质瘤患者临床病理特征，如Ki-67阳性或TP53基因突变都有明显的相关性。生存分析表明高表达的PVT1与低表达的HAR1A可能是弥漫性胶质瘤患者的独立预后生物标志物。并且，放化疗生存效果评估分析发现PVT1低表达和 HAR1A 高表达的胶质瘤患者接受药物治疗或放射治疗后可获得更好的生存，这表明异常表达的PVT1与HAR1A可作为辅助放化疗效果评估的指示物。
LincRNAs 的疾病或组织特异的表达模式与临床意义提示它们具有独特的生物学活性和功能。从以上差异表达的 lincRNAs 中选取LINC01094做进一步的研究，分析结果表明LINC01094在人脑组织中的表达丰度相对较高，在弥漫性胶质瘤组织与胶质瘤细胞中均显著高表达。在胶质瘤细胞中，LINC01094干扰后可抑制细胞增殖活性、减少集落形成数目、促进细胞死亡，而LINC01094过表达后细胞增殖活性与集落形成数目均增加。在蛋白水平上LINC01094干扰后胶质瘤细胞中增殖生长相关蛋白p27表达增加，细胞凋亡相关蛋白Bcl-2/ Bax的比例降低，PARP表达减少；而过表达的细胞中p27蛋白表达下调。裸鼠皮下成瘤实验显示LINC01094敲减后裸鼠移植瘤生长速度变慢，移植瘤体积与对照组相比显著减小；瘤组织标本H&E染色与免疫组化染色显示 LINC01094 敲减后的组织中破碎细胞与核固缩现象较多， Ki-67阳性细胞率减少，这提示敲减LINC01094可抑制裸鼠体内胶质瘤细胞的增殖生长。并且，在胶质瘤细胞中，LINC01094干扰后细胞的水平迁移率、纵向迁移与侵袭能力显著减弱，而过表达的细胞迁移率增加；蛋白水平上 LINC01094 干扰后细胞迁移与侵袭相关蛋白 E-cadherin表达增加，Vimentin表达减少，过表达的细胞中Vimentin蛋白表达上调，而ZO1与ANXA2蛋白表达变化都不显著。此外，我们还考察了LINC01094对替莫唑胺(TMZ)药物处理的影响，药物实验表明低浓度TMZ药物处理后的胶质瘤细胞生长变缓慢、细胞触角收缩变肿胀、部分细胞死亡，而将LINC01094干扰后再加低浓度TMZ药物处理胶质瘤细胞，其细胞存活率与IC50值均降低，集落形成数目明显减少甚至消失，细胞凋亡比例显著增加，这些结果表明LINC01094可增加胶质瘤细胞对替莫唑胺(TMZ)药物处理的敏感性水平。
通过RNA-FISH技术结合细胞亚组份分离实验发现LINC01094在胶质瘤细胞质与细胞核中的均有分布，但主要分布于细胞质中。基于生物信息学网站的预测可知miR-340-5p与LINC01094有多个互补结合位点。miR-340-5p 在弥漫性胶质瘤中的低表达，这与高表达的LINC01094 呈相反关系；验证实验显示 miR-340-5p 可降低胶质瘤细胞中LINC01094的表达水平，还可降低LINC01094双荧光素酶报告基因质粒的相对荧光素酶活性，这表明miR-340-5p与LINC01094序列存在互补结合的碱基位点。胶质瘤细胞的RNA pull-down与RIP技术显示在实验产物中 miR-340-5p 与 LINC01094 的表达富集度较高， LINC01094可与结合蛋白Ago2形成RNA-蛋白复合物来吸附结合miR-340-5p。细胞生物学表型实验显示在胶质瘤细胞中miR-340-5p可抑制细胞增殖生长、减少细胞集落形成数目、促进细胞核染色质固缩与细胞DNA的碎片化而使细胞死亡增加；蛋白水平上miR-340-5p可使胶质瘤细胞中增殖生长相关蛋白 p27 表达增加，CDK2 表达减少；细胞凋亡死亡相关蛋白Bcl-2/ Bax的比例降低，PARP蛋白减少,相应的裂解成份增加。miR-340-5p 也可减弱胶质瘤细胞的迁移与侵袭能力，使相关蛋白E-cadherin表达增加，Vimentin表达减少，这表明miR-340-5p 可在胶质瘤细胞中发挥重要作用。细胞挽救实验显示在胶质瘤细胞中过表达LINC01094可抵消miR-340-5p对细胞增殖生长、集落形成能力、细胞迁移与侵袭能力的影响，并且相关蛋白 p27 与Vimentin的表达也恢复正常，这表明LINC01094可通过“海绵”吸附作用影响miR-340-5p在胶质瘤细胞中的生物学功能。
根据生物信息学网站的预测，找到了miR-340-5p靶向调控的多个下游编码基因，如API5（凋亡抑制因子5）；在弥漫性胶质瘤中API5的 mRNA 与蛋白质明显高表达，这与低表达的 miR-340-5p 呈相反关系。细胞实验显示miR-340-5p可降低胶质瘤细胞中API5 mRNA与蛋白的表达水平，也可降低API5基因3’-UTR区域野生型双荧光素酶报告基因质粒在胶质瘤细胞中的相对荧光素酶活性。RNA pull-down与RIP技术实验显示miR-340-5p可与API5基因3’-UTR区域序列上的碱基互补结合形成RNA诱导沉默复合体（RISC），从而降解API5的mRNA或阻遏蛋白翻译，这表明miR-340-5p与API5的3’-UTR区域序列上存在互补结合的碱基位点。在胶质瘤细胞中干扰API5可抑制细胞增殖生长、减少集落形成数目、促进细胞核染色质固缩和细胞DNA的碎片化而使细胞死亡增加；蛋白水平上API5干扰后的胶质瘤细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2/ Bax的比例降低，Caspase-3蛋白表达上调，PARP 蛋白减少,相应的裂解成份增加，这表明 API5 可影响胶质瘤细胞的增殖与凋亡，API5 可能是 miR-340-5p 调控的一个下游靶基因。
综上所述,研究结果表明LINC01094是一个在弥漫性胶质瘤中差异表达的lincRNAs，LINC01094可调节胶质瘤细胞的细胞增殖、凋亡死亡、迁移与侵袭能力，可促进体内肿瘤的生长，并影响TMZ药物治疗的敏感性。LINC01094可作为竞争性内源RNA，通过“海绵”作用吸附结合miR-340-5p，而API5是miR-340-5p的一个下游靶基因。
在本研究中，通过对GEO胶质瘤数据集GSE4290的生物信息学分析，鉴定筛选出了在弥漫性胶质瘤中差异表达的lincRNAs，如：PVT1、HAR1A、LINC01094与MIAT。与非肿瘤对照组相比LINC01094与PVT1在弥漫性胶质瘤中的表达均明显上调，而HAR1A和MIAT在胶质瘤中均显著低表达；这四个异常表达的lincRNAs与胶质瘤患者临床病理特征，如Ki-67阳性或TP53基因突变都有明显的相关性。生存分析表明高表达的PVT1与低表达的HAR1A可能是弥漫性胶质瘤患者的独立预后生物标志物。并且，放化疗生存效果评估分析发现PVT1低表达和 HAR1A 高表达的胶质瘤患者接受药物治疗或放射治疗后可获得更好的生存，这表明异常表达的PVT1与HAR1A可作为辅助放化疗效果评估的指示物。
LincRNAs 的疾病或组织特异的表达模式与临床意义提示它们具有独特的生物学活性和功能。从以上差异表达的 lincRNAs 中选取LINC01094做进一步的研究，分析结果表明LINC01094在人脑组织中的表达丰度相对较高，在弥漫性胶质瘤组织与胶质瘤细胞中均显著高表达。在胶质瘤细胞中，LINC01094干扰后可抑制细胞增殖活性、减少集落形成数目、促进细胞死亡，而LINC01094过表达后细胞增殖活性与集落形成数目均增加。在蛋白水平上LINC01094干扰后胶质瘤细胞中增殖生长相关蛋白p27表达增加，细胞凋亡相关蛋白Bcl-2/ Bax的比例降低，PARP表达减少；而过表达的细胞中p27蛋白表达下调。裸鼠皮下成瘤实验显示LINC01094敲减后裸鼠移植瘤生长速度变慢，移植瘤体积与对照组相比显著减小；瘤组织标本H&E染色与免疫组化染色显示 LINC01094 敲减后的组织中破碎细胞与核固缩现象较多， Ki-67阳性细胞率减少，这提示敲减LINC01094可抑制裸鼠体内胶质瘤细胞的增殖生长。并且，在胶质瘤细胞中，LINC01094干扰后细胞的水平迁移率、纵向迁移与侵袭能力显著减弱，而过表达的细胞迁移率增加；蛋白水平上 LINC01094 干扰后细胞迁移与侵袭相关蛋白 E-cadherin表达增加，Vimentin表达减少，过表达的细胞中Vimentin蛋白表达上调，而ZO1与ANXA2蛋白表达变化都不显著。此外，我们还考察了LINC01094对替莫唑胺(TMZ)药物处理的影响，药物实验表明低浓度TMZ药物处理后的胶质瘤细胞生长变缓慢、细胞触角收缩变肿胀、部分细胞死亡，而将LINC01094干扰后再加低浓度TMZ药物处理胶质瘤细胞，其细胞存活率与IC50值均降低，集落形成数目明显减少甚至消失，细胞凋亡比例显著增加，这些结果表明LINC01094可增加胶质瘤细胞对替莫唑胺(TMZ)药物处理的敏感性水平。
通过RNA-FISH技术结合细胞亚组份分离实验发现LINC01094在胶质瘤细胞质与细胞核中的均有分布，但主要分布于细胞质中。基于生物信息学网站的预测可知miR-340-5p与LINC01094有多个互补结合位点。miR-340-5p 在弥漫性胶质瘤中的低表达，这与高表达的LINC01094 呈相反关系；验证实验显示 miR-340-5p 可降低胶质瘤细胞中LINC01094的表达水平，还可降低LINC01094双荧光素酶报告基因质粒的相对荧光素酶活性，这表明miR-340-5p与LINC01094序列存在互补结合的碱基位点。胶质瘤细胞的RNA pull-down与RIP技术显示在实验产物中 miR-340-5p 与 LINC01094 的表达富集度较高， LINC01094可与结合蛋白Ago2形成RNA-蛋白复合物来吸附结合miR-340-5p。细胞生物学表型实验显示在胶质瘤细胞中miR-340-5p可抑制细胞增殖生长、减少细胞集落形成数目、促进细胞核染色质固缩与细胞DNA的碎片化而使细胞死亡增加；蛋白水平上miR-340-5p可使胶质瘤细胞中增殖生长相关蛋白 p27 表达增加，CDK2 表达减少；细胞凋亡死亡相关蛋白Bcl-2/ Bax的比例降低，PARP蛋白减少,相应的裂解成份增加。miR-340-5p 也可减弱胶质瘤细胞的迁移与侵袭能力，使相关蛋白E-cadherin表达增加，Vimentin表达减少，这表明miR-340-5p 可在胶质瘤细胞中发挥重要作用。细胞挽救实验显示在胶质瘤细胞中过表达LINC01094可抵消miR-340-5p对细胞增殖生长、集落形成能力、细胞迁移与侵袭能力的影响，并且相关蛋白 p27 与Vimentin的表达也恢复正常，这表明LINC01094可通过“海绵”吸附作用影响miR-340-5p在胶质瘤细胞中的生物学功能。
根据生物信息学网站的预测，找到了miR-340-5p靶向调控的多个下游编码基因，如API5（凋亡抑制因子5）；在弥漫性胶质瘤中API5的 mRNA 与蛋白质明显高表达，这与低表达的 miR-340-5p 呈相反关系。细胞实验显示miR-340-5p可降低胶质瘤细胞中API5 mRNA与蛋白的表达水平，也可降低API5基因3’-UTR区域野生型双荧光素酶报告基因质粒在胶质瘤细胞中的相对荧光素酶活性。RNA pull-down与RIP技术实验显示miR-340-5p可与API5基因3’-UTR区域序列上的碱基互补结合形成RNA诱导沉默复合体（RISC），从而降解API5的mRNA或阻遏蛋白翻译，这表明miR-340-5p与API5的3’-UTR区域序列上存在互补结合的碱基位点。在胶质瘤细胞中干扰API5可抑制细胞增殖生长、减少集落形成数目、促进细胞核染色质固缩和细胞DNA的碎片化而使细胞死亡增加；蛋白水平上API5干扰后的胶质瘤细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2/ Bax的比例降低，Caspase-3蛋白表达上调，PARP 蛋白减少,相应的裂解成份增加，这表明 API5 可影响胶质瘤细胞的增殖与凋亡，API5 可能是 miR-340-5p 调控的一个下游靶基因。
综上所述,研究结果表明LINC01094是一个在弥漫性胶质瘤中差异表达的lincRNAs，LINC01094可调节胶质瘤细胞的细胞增殖、凋亡死亡、迁移与侵袭能力，可促进体内肿瘤的生长，并影响TMZ药物治疗的敏感性。LINC01094可作为竞争性内源RNA，通过“海绵”作用吸附结合miR-340-5p，而API5是miR-340-5p的一个下游靶基因。