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目的:
建立实验性胆囊炎家兔模型,以诱发循经高温反应现象,通过红外热像仪观察循经高温反应现象的分布特点、检测温度值变化；采用分子生物学方法研究循经脂肪组织中UCP1mRNA表达增强产热与产生循经高温反应现象的相关性,为揭示循经高温反应的机制提供实验依据。
方法:
本研究共分为两部分。
第一部分,将家兔随机分为实验性胆囊炎家兔模型组和空白对照组；采用胆总管缩窄结扎并于胆囊内注射大肠杆菌液的造模方法,建立实验性胆囊炎家兔模型。分别采用红外热像仪与红外温度计于术前及术后第14天在模型两侧腹部循胆经部位,进行测温、采集图像和温度数据。分析实验性胆囊炎家兔造模术诱导循经高温现象产生的成功率；观察家兔体表产生的循经高温现象的分布特点及检测指标的动态变化,对两种检测指标进行比较；对家兔术后第14天与术前温度变化进行比较。
第二部分,采用成功诱导产生循经高温现象的实验家兔模型组及与其相对应的空白对照组家兔作为实验动物,于术后第14天取材。分别用UNIQ-10离心柱法和Trizol法提取实验家兔两侧腹部循胆经出现循经高温线的部位的脂肪组织总RNA,并对两种方法提取的总RNA进行比较,选择其中之一作为最为适宜的提取方法。提取的总RNA逆转录后,利用实时定量PCR技术对循经高温现象产生部位脂肪组织中UCP1mRNA表达水平进行检测,以观察实验性胆囊炎家兔模型诱导的循经高温现象的产生对脂肪组织中UCP1基因表达水平的影响。
结果:
第一部分
1.红外热像仪采集图像与红外温度计测温测定实验家兔两侧腹部循胆经部位温度数据相比较,发现这两种方法所检测出的温度值变化的趋势基本一致,即兔术后第14天被测部位温度较术前升高:并且头侧温度高于尾侧温度。这一观察结果表明,虽红外温度计与红外热像扫描仪所得出的结果在精度上会有差别(1℃左右),但这两种方法在客观地反映循经温度变化的趋势上是基本一致的。故此本实验建立的红外温度计检测循经高温反应的方法具有可行性,作为本实验的手段之一,保障了相关实验数据采集和顺利进行。
2.对成功诱导产生的循经高温现象的模型进行观察发现:家兔躯干双侧面可出现纵向高温线,其走行与足少阳胆经走行一致,有些较宽,偶有覆盖其它经和串经现象。平均长度为5～9 cm,最长可达躯干全长。其温度变化趋势的特点是:头侧温度高于尾侧,并且右侧出现的高温线温度值较左侧温度值高。
3.在实验性胆囊炎家兔造模术诱导循经高温现象产生的成功率分析中,通过对检测指标及图表进行分析得出,实验模型出现循经高温反应现象的成功率约为60％。
4.在利用实验性胆囊炎家兔造模术诱导循经高温现象产生的实验中,对红外温度计测温法测得的温度数据进行统计学分析,得出:模型组家兔被测部位温度同体比较术后第14天较术前有显著性增高(P<0.01)；空白对照组家兔同体比较前后测温差异无显著性(P>0.01)；模型组与对照组家兔被测部位术后第14天与术前温度差值的组间比较,模型组较空白对照组均有非常显著性(P<0.01)。
第二部分
1.脂肪组织总RNA的提取方法是分析UCP1mRNA的关键技术,而根据实验检测指标需要摸索出适合本实验要求的提取方法。通过反复摸索,发现。Trizol法更适合作为本实验脂肪组织总RNA的提取方法。在UNIQ-10离心柱法和Trizol法提取的脂肪组织总RNA的比较结果中,纯度比较结果是:Trizol法、UNIQ-10离心柱法提取的总RNA分别取3个样品进行测定,经测定其OD值(A260/A280)的平均值分别为1.598、1.562,实验数据显示Trizol法提取的总RNA纯度较高,而LJNIO-10离心柱提取的总RNA纯度相对较低,离心柱试剂盒抽提的纯度稍次于传统的经典方法,但其比值均已超过质控要求；完整性比较结果是:由电泳图明显可见Trizol法、IJNIQ-10离心柱法提取的家兔脂肪组织的总RNA的条带均清晰且有一定的亮度,这表明两种方法提取的总RNA都比较完整,但Trizol法提取的总RNA的条带清晰度及亮度均高于UNIQ—10离心柱法提取的总RNA的条带,表明其完整性更好。根据以上分析,本实验最终采用了Trizol法提取总RNA。电泳结果表明所提取的总RNA符合RT及Real Time PCR的质控要求:通过将IYNIQ-10离心柱法与Trrizol法进行比较,结果显示Trizol法更适合作为本实验脂肪组织总RNA的提取方法。
2.在分析循经高温现象的产生对脂肪组织中UCP1mRNA表达的影响的实验中,模型组和窄白对照组家兔被测部位Real-Time PCR测定的脂肪组织UCP1基因表达水平测定结果:模型组Ct值较空白对照组明显降低,表明模型组被测部位脂肪组织中UCP1mRNA基因表达水平明显升高(P<0.01)。
结论:
1.利用实验件胆囊炎家兔造模术可以诱导模型腹部沿胆经出现循经高温反应现象,并有一定分布特征,其温度变化趋势的特点是:头侧温度高于尾侧,并且右侧出现的高温线温度值较左侧温度值高。
2.本实验建立的红外温度计简易测温方法可以客观地反映循经高温反应的温度变化,具有实用、简便和经济性与普及价值。
3.实验性胆囊炎模型家兔出现循经高温反应时,循经脂肪组织中UCP1的基因表达水平升高,表明脂肪组织产热增加。因此,结果提示UCP1与循经高温反应现象具有密切相关性。
建立实验性胆囊炎家兔模型,以诱发循经高温反应现象,通过红外热像仪观察循经高温反应现象的分布特点、检测温度值变化；采用分子生物学方法研究循经脂肪组织中UCP1mRNA表达增强产热与产生循经高温反应现象的相关性,为揭示循经高温反应的机制提供实验依据。
方法:
本研究共分为两部分。
第一部分,将家兔随机分为实验性胆囊炎家兔模型组和空白对照组；采用胆总管缩窄结扎并于胆囊内注射大肠杆菌液的造模方法,建立实验性胆囊炎家兔模型。分别采用红外热像仪与红外温度计于术前及术后第14天在模型两侧腹部循胆经部位,进行测温、采集图像和温度数据。分析实验性胆囊炎家兔造模术诱导循经高温现象产生的成功率；观察家兔体表产生的循经高温现象的分布特点及检测指标的动态变化,对两种检测指标进行比较；对家兔术后第14天与术前温度变化进行比较。
第二部分,采用成功诱导产生循经高温现象的实验家兔模型组及与其相对应的空白对照组家兔作为实验动物,于术后第14天取材。分别用UNIQ-10离心柱法和Trizol法提取实验家兔两侧腹部循胆经出现循经高温线的部位的脂肪组织总RNA,并对两种方法提取的总RNA进行比较,选择其中之一作为最为适宜的提取方法。提取的总RNA逆转录后,利用实时定量PCR技术对循经高温现象产生部位脂肪组织中UCP1mRNA表达水平进行检测,以观察实验性胆囊炎家兔模型诱导的循经高温现象的产生对脂肪组织中UCP1基因表达水平的影响。
结果:
第一部分
1.红外热像仪采集图像与红外温度计测温测定实验家兔两侧腹部循胆经部位温度数据相比较,发现这两种方法所检测出的温度值变化的趋势基本一致,即兔术后第14天被测部位温度较术前升高:并且头侧温度高于尾侧温度。这一观察结果表明,虽红外温度计与红外热像扫描仪所得出的结果在精度上会有差别(1℃左右),但这两种方法在客观地反映循经温度变化的趋势上是基本一致的。故此本实验建立的红外温度计检测循经高温反应的方法具有可行性,作为本实验的手段之一,保障了相关实验数据采集和顺利进行。
2.对成功诱导产生的循经高温现象的模型进行观察发现:家兔躯干双侧面可出现纵向高温线,其走行与足少阳胆经走行一致,有些较宽,偶有覆盖其它经和串经现象。平均长度为5～9 cm,最长可达躯干全长。其温度变化趋势的特点是:头侧温度高于尾侧,并且右侧出现的高温线温度值较左侧温度值高。
3.在实验性胆囊炎家兔造模术诱导循经高温现象产生的成功率分析中,通过对检测指标及图表进行分析得出,实验模型出现循经高温反应现象的成功率约为60％。
4.在利用实验性胆囊炎家兔造模术诱导循经高温现象产生的实验中,对红外温度计测温法测得的温度数据进行统计学分析,得出:模型组家兔被测部位温度同体比较术后第14天较术前有显著性增高(P<0.01)；空白对照组家兔同体比较前后测温差异无显著性(P>0.01)；模型组与对照组家兔被测部位术后第14天与术前温度差值的组间比较,模型组较空白对照组均有非常显著性(P<0.01)。
第二部分
1.脂肪组织总RNA的提取方法是分析UCP1mRNA的关键技术,而根据实验检测指标需要摸索出适合本实验要求的提取方法。通过反复摸索,发现。Trizol法更适合作为本实验脂肪组织总RNA的提取方法。在UNIQ-10离心柱法和Trizol法提取的脂肪组织总RNA的比较结果中,纯度比较结果是:Trizol法、UNIQ-10离心柱法提取的总RNA分别取3个样品进行测定,经测定其OD值(A260/A280)的平均值分别为1.598、1.562,实验数据显示Trizol法提取的总RNA纯度较高,而LJNIO-10离心柱提取的总RNA纯度相对较低,离心柱试剂盒抽提的纯度稍次于传统的经典方法,但其比值均已超过质控要求；完整性比较结果是:由电泳图明显可见Trizol法、IJNIQ-10离心柱法提取的家兔脂肪组织的总RNA的条带均清晰且有一定的亮度,这表明两种方法提取的总RNA都比较完整,但Trizol法提取的总RNA的条带清晰度及亮度均高于UNIQ—10离心柱法提取的总RNA的条带,表明其完整性更好。根据以上分析,本实验最终采用了Trizol法提取总RNA。电泳结果表明所提取的总RNA符合RT及Real Time PCR的质控要求:通过将IYNIQ-10离心柱法与Trrizol法进行比较,结果显示Trizol法更适合作为本实验脂肪组织总RNA的提取方法。
2.在分析循经高温现象的产生对脂肪组织中UCP1mRNA表达的影响的实验中,模型组和窄白对照组家兔被测部位Real-Time PCR测定的脂肪组织UCP1基因表达水平测定结果:模型组Ct值较空白对照组明显降低,表明模型组被测部位脂肪组织中UCP1mRNA基因表达水平明显升高(P<0.01)。
结论:
1.利用实验件胆囊炎家兔造模术可以诱导模型腹部沿胆经出现循经高温反应现象,并有一定分布特征,其温度变化趋势的特点是:头侧温度高于尾侧,并且右侧出现的高温线温度值较左侧温度值高。
2.本实验建立的红外温度计简易测温方法可以客观地反映循经高温反应的温度变化,具有实用、简便和经济性与普及价值。
3.实验性胆囊炎模型家兔出现循经高温反应时,循经脂肪组织中UCP1的基因表达水平升高,表明脂肪组织产热增加。因此,结果提示UCP1与循经高温反应现象具有密切相关性。