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目的：
通过筛选,将筛选合格的健康正常SD大鼠40只,随机分为正常对照组,假手术对照组、AD对照模型组、模型+中药低剂量组、模型+中药高剂量组,每组各8只。参照文献方法,应用Aβ25-35,依照大鼠脑立体图谱,通过脑立体定位仪,建立AD大鼠病理模型,通过对大鼠进行学习训练、定位航行、行为学、病理形态学观察、以及细胞凋亡、内质网应激(ERS)重要蛋白表达水平的检测,以期阐明本方法建立的阿尔茨海默病(AD)模型大鼠学习记忆功能的改变,以及天泰1号对Aβ25-35诱导的AD大鼠模型的学习记忆能力的影响及其药理药效机理。
方法
本实验包括两部分:一、动物行为学实验研究；二、海马组织病理观察、细胞凋亡及ERS重要蛋白检测。
1、动物行为学实验研究
利用Morris水迷宫进行动物筛选,大鼠适应性饲养3天后进行Morris水迷宫实验,Morris水迷宫实验测试过程分学习训练、定位航行试验二部分。将安全平台放置在西南象限(直径150cm的圆形不锈钢水池被软件平均分为四个象限,即NE、SE、SW、NW的固定位置(离池壁20cm),向Morris不锈钢水池中注入自来水,以水面高过安全平台2cm为宜,水池中水温保持在24-25℃。将摄像装置安装在水池的正上方,按仪器说明书连接好摄像机、计算机,整套实验设备安装在光线良好、实验环境固定的房间。先运行计算机,设定参数后进行实验。实验前将动物不放入水池,软件先确认背景,然后放入大鼠于安全台上,软件自动识别大鼠为目标后开始实验。将定位航行时间超过平均值30％的大鼠剔除,剩余大鼠作为实验用。
阿尔茨海默病(Alzheimers Disease,AD)大鼠模型的建立:在质量分数为4％的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉下,用脑立体定位仪固定大鼠,取平颅头位,根据大鼠脑立体定位图谱,确定前囟后3.6mm、中线旁2.5mm为颅骨表面标志点,颅骨表面下3.0mm为海马背侧部,用1ul微量注射器5min内缓慢注入凝聚态Aβ25-351ul,予以留针10min。术后给予青霉素钠盐5万单位肌注,每天一次。正常组大鼠颈背部注射0.9％生理盐水0.6ml/kg,AD模型组和假手术组大鼠均皮下注射D-半乳糖150mg/kg。第26天开始Morris水迷宫实验,连续实验5天,将行为学结果进行统计学分析。末次行为学实验结束后断头处死大鼠,取左半脑用4％多聚甲醛固定。根据行为学结果初步评价AD模型的成功与否。
在制备AD大鼠疾病模型成功的基础上,按以上方法制备大鼠AD疾病模型。将大鼠随机分为5组,即天泰1号方大、小剂量2个组,AD模型组与正常对照组和假手术组,每组8只大鼠(SD大鼠、SPF级、雄性、240-270g,均饲养在屏障环境中,常规给食物和水),天泰1号方大、小剂量组大鼠分别灌胃给予10％、5％的天泰1号方10ml/kg,假手术组和正常对照组则以相同的方式给予同体积的生理盐水,每日1次,连续给药30天。从给药第26天开始进行行为学实验,实验内容包括学习训练和定位航行实验二部分。
2、海马组织病理观察、细胞凋亡及ERS重要蛋白检测
末次行为学实验结束后断头处死大鼠,取全脑。其右脑保存于液氮中,左脑用4％多聚甲醛固定。左脑进行常规尼氏和刚果红染色,观察脑组织结构、细胞的形态和海马CA1、CA3和DG区神经元数量；各组切片中随机选5张进行病理学观察,自动图像分析系统计算出海马 DG 背侧细胞带的平均神经元数；各组切片中随机选5张观察β-AP和磷酸化tau蛋白；各组切片中随机选5张镜下观察,统一放大倍数(×400)下,每张切片的海马CA1、CA3和DG区分别随机取4个视野,自动图像分析系统计算所要观察部位的平均阳性细胞数；取各组脑组织切片,用TUNEL法检测细胞凋亡,重点观察海马神经元凋亡情况,显微镜下观测,每张切片随机选取5个高倍视野,计算细胞凋亡指数(AI)；取各组脑组织切片,免疫组织化学法Leica QWin V3分析软件定量检测各组动物海马组织PERK、GRP78/Bip、CHOP蛋白表达水平。
结果
1.Morris水迷宫是检测实验动物学习记忆水平的重要工具,学习测试有利于筛选具有正常学习记忆能力的动物,记忆测试可以判断动物记忆储存能力及提取再现能力。经过学习和训练可以把正常对照组和模型组明显区分开来,正常对照组学习记忆能力强,空间定位能力好,模型组学习记忆能力明显下降,逃避潜伏期明显延长,提示Aβ25-35造成大鼠学习记忆能力的损害。
2.通过Morris水迷宫测试,天泰1号方大、小剂量组与AD模型组比较,在学习训练、定位航行实验时达到安全平台的时间和距离缩短,提示天泰1号能显著改善AD大鼠的学习记忆能力。
3.常规尼氏染色各组切片中随机选5张进行病理学观察,自动图像分析系统计算出海马DG背侧细胞带的平均神经元数。方差分析结果显示,各组大鼠海马DG背侧细胞带的神经元数量比较差异有统计学意义(F=75.433,P<0.001)。其中,AD模型组较正常组及假手术组神经元数量减少,差异有显著性意义(P<0.001)；天泰高剂量组及天泰低剂量组较AD模型组神经元数量增加,差异有显著性意义(P<0.001)。
4.淀粉样蛋白刚果红染色发现,AD模型组与正常组、假手术组相比较淀粉样蛋白斑块显著增多,与AD模型组相比较,中药组淀粉样斑块减少,提示天泰1号具有抗淀粉样斑块形成的药效作用。
5.β-AP免疫组织化学染色,自动图像分析系统计算所要观察部位的平均阳性细胞数。各组大鼠海马CA1、CA3和DG区平均阳性细胞数比较:方差分析显示,各组大鼠海马CA1、CA3和DG区平均阳性细胞数比较,差异有统计学意义(F=20.065,P<0.001；F=24.007,P<0.001；F=22.987,P<0.001)。AD模型组较正常组、假手术组CA1、CA3和DG区平均阳性细胞数显著增多,差异有显著性意义(P<0.001)；天泰高剂量组、天泰低剂量组与AD模型组比较,CA1、CA3和DG区平均阳性细胞数明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。
6.磷酸化tau蛋白免疫组织化学染色各组大鼠海马CA1、CA3和DG区平均阳性细胞数比较:方差分析显示,各组大鼠海马CA1、CA3和DG区平均阳性细胞数比较,差异有统计学意义(F=16.982,P<0.001；F=21.510,P<0.001；F=15.971,P<0.001)。AD模型组较正常组、假手术组CA1、CA3和DG区平均阳性细胞数显著增多,差异有显著性意义(P<0.001)；天泰高剂量组、天泰低剂量组与AD模型组比较,CA1、CA3和DG区平均阳性细胞数明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。
7.左半脑组织TUNEL法检测细胞凋亡实验发现,方差分析显示各组凋亡率差异有统计学意义(F=123.478,P<0.001)。组间多重比较显示,AD模型组凋亡率较正常组及假手术组明显增高,差异有显著性意义(P<0.001)；天泰高、低剂量组较AD模型组神经元细胞凋亡率明显降低,差异有统计学意义(P<0.001:P<0.043)。
8.免疫组织化学法检测各组动物海马组织ERS重要相关蛋白,各组PERK、GRP78/Bip、CHOP蛋白平均灰度值比较:方差分析显示,各组PERK、GRP78/Bip、CHOP蛋白平均灰度值比较,差异有统计学意义(F=186.104,P<0.001；F=312.133,P<0.001；F=2765.613,P<0.001)。AD模型组与正常组、假手术组比较,PERK、GRP78/Bip、CHOP蛋白平均灰度值显著降低,差异有统计学意义(P<0.001)；天泰高剂量组、天泰低剂量组与AD模型组比较,PERK、CHOP蛋白平均灰度值明显增高,差异有统计学意义(P<0.05),天泰高剂量组、天泰低剂量组与AD模型组比较,GRP78/Bip蛋白平均灰度值明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),提示天泰1号方在抗AD机理可能与其影响细胞的ERS有关。
结论
本研究以Aβ25-35联合D-半乳糖建立AD动物模型,并观察天泰1号对该病理模型认知障碍的影响和海马组织病理观察、细胞凋亡及ERS重要蛋白检测。结果显示Aβ25-35联合D-半乳糖建立的AD病理模型学习记忆认知功能显著障碍,天泰1号对该病理模型的认知功能显著障碍具有改善作用,研究表明Aβ25-35联合D-半乳糖可以成功建立复合性AD动物病理模型,该模型既模拟了老年性痴呆的认知行为障碍,又具有整体衰老的体内生理病理环境,为深入开展老年性痴呆的发病机制及药效学靶点研究提供了可行的在体模型；PERK为ERS感应和保护性信号通路调控蛋白、GRP78/Bip为内质网应激早期标志和保护性蛋白、CHOP为凋亡促进因子,天泰1号能够显著减少PERK、CHOP蛋白的表达水平,提高GRP78/Bip的表达水平,提示,天泰1号的抗AD作用机理涉及其抗凋亡、抗内质网应激等多重途径。
通过筛选,将筛选合格的健康正常SD大鼠40只,随机分为正常对照组,假手术对照组、AD对照模型组、模型+中药低剂量组、模型+中药高剂量组,每组各8只。参照文献方法,应用Aβ25-35,依照大鼠脑立体图谱,通过脑立体定位仪,建立AD大鼠病理模型,通过对大鼠进行学习训练、定位航行、行为学、病理形态学观察、以及细胞凋亡、内质网应激(ERS)重要蛋白表达水平的检测,以期阐明本方法建立的阿尔茨海默病(AD)模型大鼠学习记忆功能的改变,以及天泰1号对Aβ25-35诱导的AD大鼠模型的学习记忆能力的影响及其药理药效机理。
方法
本实验包括两部分:一、动物行为学实验研究；二、海马组织病理观察、细胞凋亡及ERS重要蛋白检测。
1、动物行为学实验研究
利用Morris水迷宫进行动物筛选,大鼠适应性饲养3天后进行Morris水迷宫实验,Morris水迷宫实验测试过程分学习训练、定位航行试验二部分。将安全平台放置在西南象限(直径150cm的圆形不锈钢水池被软件平均分为四个象限,即NE、SE、SW、NW的固定位置(离池壁20cm),向Morris不锈钢水池中注入自来水,以水面高过安全平台2cm为宜,水池中水温保持在24-25℃。将摄像装置安装在水池的正上方,按仪器说明书连接好摄像机、计算机,整套实验设备安装在光线良好、实验环境固定的房间。先运行计算机,设定参数后进行实验。实验前将动物不放入水池,软件先确认背景,然后放入大鼠于安全台上,软件自动识别大鼠为目标后开始实验。将定位航行时间超过平均值30％的大鼠剔除,剩余大鼠作为实验用。
阿尔茨海默病(Alzheimers Disease,AD)大鼠模型的建立:在质量分数为4％的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉下,用脑立体定位仪固定大鼠,取平颅头位,根据大鼠脑立体定位图谱,确定前囟后3.6mm、中线旁2.5mm为颅骨表面标志点,颅骨表面下3.0mm为海马背侧部,用1ul微量注射器5min内缓慢注入凝聚态Aβ25-351ul,予以留针10min。术后给予青霉素钠盐5万单位肌注,每天一次。正常组大鼠颈背部注射0.9％生理盐水0.6ml/kg,AD模型组和假手术组大鼠均皮下注射D-半乳糖150mg/kg。第26天开始Morris水迷宫实验,连续实验5天,将行为学结果进行统计学分析。末次行为学实验结束后断头处死大鼠,取左半脑用4％多聚甲醛固定。根据行为学结果初步评价AD模型的成功与否。
在制备AD大鼠疾病模型成功的基础上,按以上方法制备大鼠AD疾病模型。将大鼠随机分为5组,即天泰1号方大、小剂量2个组,AD模型组与正常对照组和假手术组,每组8只大鼠(SD大鼠、SPF级、雄性、240-270g,均饲养在屏障环境中,常规给食物和水),天泰1号方大、小剂量组大鼠分别灌胃给予10％、5％的天泰1号方10ml/kg,假手术组和正常对照组则以相同的方式给予同体积的生理盐水,每日1次,连续给药30天。从给药第26天开始进行行为学实验,实验内容包括学习训练和定位航行实验二部分。
2、海马组织病理观察、细胞凋亡及ERS重要蛋白检测
末次行为学实验结束后断头处死大鼠,取全脑。其右脑保存于液氮中,左脑用4％多聚甲醛固定。左脑进行常规尼氏和刚果红染色,观察脑组织结构、细胞的形态和海马CA1、CA3和DG区神经元数量；各组切片中随机选5张进行病理学观察,自动图像分析系统计算出海马 DG 背侧细胞带的平均神经元数；各组切片中随机选5张观察β-AP和磷酸化tau蛋白；各组切片中随机选5张镜下观察,统一放大倍数(×400)下,每张切片的海马CA1、CA3和DG区分别随机取4个视野,自动图像分析系统计算所要观察部位的平均阳性细胞数；取各组脑组织切片,用TUNEL法检测细胞凋亡,重点观察海马神经元凋亡情况,显微镜下观测,每张切片随机选取5个高倍视野,计算细胞凋亡指数(AI)；取各组脑组织切片,免疫组织化学法Leica QWin V3分析软件定量检测各组动物海马组织PERK、GRP78/Bip、CHOP蛋白表达水平。
结果
1.Morris水迷宫是检测实验动物学习记忆水平的重要工具,学习测试有利于筛选具有正常学习记忆能力的动物,记忆测试可以判断动物记忆储存能力及提取再现能力。经过学习和训练可以把正常对照组和模型组明显区分开来,正常对照组学习记忆能力强,空间定位能力好,模型组学习记忆能力明显下降,逃避潜伏期明显延长,提示Aβ25-35造成大鼠学习记忆能力的损害。
2.通过Morris水迷宫测试,天泰1号方大、小剂量组与AD模型组比较,在学习训练、定位航行实验时达到安全平台的时间和距离缩短,提示天泰1号能显著改善AD大鼠的学习记忆能力。
3.常规尼氏染色各组切片中随机选5张进行病理学观察,自动图像分析系统计算出海马DG背侧细胞带的平均神经元数。方差分析结果显示,各组大鼠海马DG背侧细胞带的神经元数量比较差异有统计学意义(F=75.433,P<0.001)。其中,AD模型组较正常组及假手术组神经元数量减少,差异有显著性意义(P<0.001)；天泰高剂量组及天泰低剂量组较AD模型组神经元数量增加,差异有显著性意义(P<0.001)。
4.淀粉样蛋白刚果红染色发现,AD模型组与正常组、假手术组相比较淀粉样蛋白斑块显著增多,与AD模型组相比较,中药组淀粉样斑块减少,提示天泰1号具有抗淀粉样斑块形成的药效作用。
5.β-AP免疫组织化学染色,自动图像分析系统计算所要观察部位的平均阳性细胞数。各组大鼠海马CA1、CA3和DG区平均阳性细胞数比较:方差分析显示,各组大鼠海马CA1、CA3和DG区平均阳性细胞数比较,差异有统计学意义(F=20.065,P<0.001；F=24.007,P<0.001；F=22.987,P<0.001)。AD模型组较正常组、假手术组CA1、CA3和DG区平均阳性细胞数显著增多,差异有显著性意义(P<0.001)；天泰高剂量组、天泰低剂量组与AD模型组比较,CA1、CA3和DG区平均阳性细胞数明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。
6.磷酸化tau蛋白免疫组织化学染色各组大鼠海马CA1、CA3和DG区平均阳性细胞数比较:方差分析显示,各组大鼠海马CA1、CA3和DG区平均阳性细胞数比较,差异有统计学意义(F=16.982,P<0.001；F=21.510,P<0.001；F=15.971,P<0.001)。AD模型组较正常组、假手术组CA1、CA3和DG区平均阳性细胞数显著增多,差异有显著性意义(P<0.001)；天泰高剂量组、天泰低剂量组与AD模型组比较,CA1、CA3和DG区平均阳性细胞数明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。
7.左半脑组织TUNEL法检测细胞凋亡实验发现,方差分析显示各组凋亡率差异有统计学意义(F=123.478,P<0.001)。组间多重比较显示,AD模型组凋亡率较正常组及假手术组明显增高,差异有显著性意义(P<0.001)；天泰高、低剂量组较AD模型组神经元细胞凋亡率明显降低,差异有统计学意义(P<0.001:P<0.043)。
8.免疫组织化学法检测各组动物海马组织ERS重要相关蛋白,各组PERK、GRP78/Bip、CHOP蛋白平均灰度值比较:方差分析显示,各组PERK、GRP78/Bip、CHOP蛋白平均灰度值比较,差异有统计学意义(F=186.104,P<0.001；F=312.133,P<0.001；F=2765.613,P<0.001)。AD模型组与正常组、假手术组比较,PERK、GRP78/Bip、CHOP蛋白平均灰度值显著降低,差异有统计学意义(P<0.001)；天泰高剂量组、天泰低剂量组与AD模型组比较,PERK、CHOP蛋白平均灰度值明显增高,差异有统计学意义(P<0.05),天泰高剂量组、天泰低剂量组与AD模型组比较,GRP78/Bip蛋白平均灰度值明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),提示天泰1号方在抗AD机理可能与其影响细胞的ERS有关。
结论
本研究以Aβ25-35联合D-半乳糖建立AD动物模型,并观察天泰1号对该病理模型认知障碍的影响和海马组织病理观察、细胞凋亡及ERS重要蛋白检测。结果显示Aβ25-35联合D-半乳糖建立的AD病理模型学习记忆认知功能显著障碍,天泰1号对该病理模型的认知功能显著障碍具有改善作用,研究表明Aβ25-35联合D-半乳糖可以成功建立复合性AD动物病理模型,该模型既模拟了老年性痴呆的认知行为障碍,又具有整体衰老的体内生理病理环境,为深入开展老年性痴呆的发病机制及药效学靶点研究提供了可行的在体模型；PERK为ERS感应和保护性信号通路调控蛋白、GRP78/Bip为内质网应激早期标志和保护性蛋白、CHOP为凋亡促进因子,天泰1号能够显著减少PERK、CHOP蛋白的表达水平,提高GRP78/Bip的表达水平,提示,天泰1号的抗AD作用机理涉及其抗凋亡、抗内质网应激等多重途径。