【摘 要】
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棉铃虫是鳞翅目夜蛾科中的一种食性杂、危害性强的世界性害虫。其寄主植物有200多种,危害农作物的方式多样,在我国长江黄河流域以及新疆地区危害严重,造成严重的经济损失。杀虫剂的滥用造成严重的环境污染,使棉铃虫产生了很强的抗药性,而且Bt抗虫棉的大量种植也使得棉铃虫发展了较强的Bt抗性,对棉花及多种作物的持续稳定发展造成了极大的威胁。因此,开发安全有效的杀虫剂已成为棉铃虫防治的当务之急。研究发现棉铃虫体
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棉铃虫是鳞翅目夜蛾科中的一种食性杂、危害性强的世界性害虫。其寄主植物有200多种,危害农作物的方式多样,在我国长江黄河流域以及新疆地区危害严重,造成严重的经济损失。杀虫剂的滥用造成严重的环境污染,使棉铃虫产生了很强的抗药性,而且Bt抗虫棉的大量种植也使得棉铃虫发展了较强的Bt抗性,对棉花及多种作物的持续稳定发展造成了极大的威胁。因此,开发安全有效的杀虫剂已成为棉铃虫防治的当务之急。研究发现棉铃虫体内缺乏合成胆固醇所需的关键酶,必须依靠固醇载体蛋白SCP-2将外源的胆固醇转运至体内以供其生长发育所需。本实验前期研究发现,棉铃虫SCP-2基因启动子区存在转录因子c-Myc的识别位点E-box元件,突变E-box元件后HaSCP-2启动子活性显著下调,但关于棉铃虫转录因子Ha-c-Myc对HaSCP-2基因表达调控的作用尚不清楚。本研究从以下四个方面展开,首先通过超表达实验和RNA干扰技术研究转录因子c-Myc对HaSCP-2基因启动子活性的影响,来探究Ha-c-Myc对HaSCP-2基因表达的调控作用。结果如下:（1）构建Ha-c-Myc蛋白的OpIE2-Ha-c-Myc-his-N1过表达重组质粒,将其转染至棉铃虫Ha细胞并检测HaSCP-2启动子的活性。结果显示Ha-c-Myc蛋白的超表达使HaSCP-2基因启动子活性显著上调了约50%。（2）设计Ha-c-Myc siRNA转染Ha细胞,通过实时荧光定量RT-PCR检测Ha-c-Myc和HaSCP-2的mRNA转录水平,结果显示抑制Ha-c-Myc的表达使得HaSCP-2 mRNA转录水平显著下降了 50%。超表达和RNA干扰实验均表明转录因子Ha-c-Myc对HaSCP-2的表达起正向调控作用。其次,分别构建了 pET-32a-c-Myc重组质粒和pFastBac TMHTA-c-Myc重组质粒,利用大肠杆菌原核表达系统和Bac-to-Bac昆虫杆状病毒真核表达系统进行Ha-c-Myc蛋白的体外表达,成功实现了 Ha-c-Myc的原核和真核表达。另外,通过荧光定量RT-PCR技术检测了棉铃虫体内c-Myc基因的时空表达谱。结果显示,不同龄期的棉铃虫c-Myc基因表达量不同,Ha-c-Myc在早期幼虫和晚期幼虫中具有较高的表达水平,而在幼虫中期表达量较低。预蛹期棉铃虫中Ha-c-Myc基因在不同的组织中均有表达。其中,表达量最高的组织是中肠,其次由高到低依次为头部、脂肪体和表皮。最后,在棉铃虫体内进一步研究了转录因子Ha-c-Myc在HaSCP-2基因表达调控中的作用,实验分别采用注射法和喂食法实施了 RNA干扰,检测干扰后Ha-c-Myc和HaSCP-2的mRNA相对表达量。通过显微注射和纳米材料介导的喂食两种方法将siRNA导入棉铃虫干扰后,Ha-c-Myc基因和HaSCP-2基因的表达量均显著下调,敲降Ha-c-Myc基因使HaSCP-2基因的表达受到较强的抑制甚至沉默,表明Ha-c-Myc是HaSCP-2转录表达的一种重要调控因子,对HaSCP-2基因的表达具有正调控作用。实施体内干扰Ha-c-Myc后,检测了棉铃虫脂肪体内胆固醇的含量变化,观察并记录了棉铃虫的生长发育过程。结果显示干扰后棉铃虫体内胆固醇含量减少,幼虫生长缓慢,发育出现异常现象、化蛹和羽化受到抑制以及繁殖力减弱。本研究从体外和体内两个水平阐明了转录因子Ha-c-Myc在HaSCP-2基因表达过程中发挥着正向调控作用,并进一步验证了 Ha-c-Myc对棉铃虫生长发育和繁殖的影响。研究结果有助于进一步深入研究HaSCP-2基因表达调控的机理,为绿色高效杀虫剂潜在靶标的研发打下重要基础。
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