埃及伊蚊和致倦库蚊对武昌罗索线虫免疫反应初探

来源 :华中师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:gdw2009
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昆虫先天免疫是其抵御病原微生物入侵的重要免疫防线。先天免疫主要是由体液免疫(Humoral immunity)和细胞免疫(Cellular immunity)组成,Toll-Spatzle 和Imd(Immune Deficency)信号通路是体液免疫的重要组成部分,调控免疫效应基因包括抗菌肽基因的表达。昆虫可以识别不同病原微生物的侵染从而激活Toll和Imd信号通路,这种非我识别(Non-self recognition)是通过昆虫的模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)识别病原体相关的分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)来完成的。关于Toll和Imd信号通路以及模式识别受体等在果蝇中研究的比较深入,但在蚊虫中研究的较少。蚊虫是人类多种致命传染疾病的重要媒介,而武昌罗索线虫(Romanomermiswuchangensis)能够感染蚊虫幼虫,可以作为蚊虫生物防治的一种手段。但我们对蚊虫能否识别武昌罗索线虫、蚊虫的哪些模式识别受体参与识别武昌罗索线虫以及线虫感染蚊虫是否诱导免疫相关基因的表达等所知甚少。本研究以埃及伊蚊(Aedes aegypti)、致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)和武昌罗索线虫为研究对象,探索埃及伊蚊和致倦库蚊对武昌罗索线虫感染的免疫反应、C-型凝集素(C-type lectins,CTLs)作为模式识别受体对武昌罗索线虫的识别、以及蚊虫CTL是否与PGRP-LC相互作用激活Imd信号通路。本实验采用武昌罗索线虫感染埃及伊蚊和致倦库蚊的方法,分别收取线虫感染后2、4、6、8天及同时期未感染线虫的孑孓样品,通过qRT-PCR分析蚊虫模式识别受体(PRRs)、信号通路关键基因和抗菌肽基因的表达情况;通过原核表达和纯化重组C-型凝集素蛋白证明埃及伊蚊AaCTLGA5和致倦库蚊CqCTL12蛋白与武昌罗索线虫感染期幼虫的结合;利用果蝇S2细胞表达的AaCTLGA5、AaPGRP-LC、CqCTL12和CqPGRP-LC蛋白验证CTL与PGRP-LC蛋白之间的互作。实验结果如下:(1)当用武昌罗索线虫感染蚊虫时,埃及伊蚊的大多数抗菌肽基因(包括AaAttB、AaDefA、AaDefB、AaCecA和AaCecB)的表达与对照组相比呈显著性上调;致倦库蚊的抗菌肽基因CqAtt和CqCec的表达与对照组相比呈显著性上调,但CqCecA和CqDef的表达与对照组相比呈显著性下调。(2)当用武昌罗索线虫感染蚊虫时,埃及伊蚊的凝集素基因AaCTLGA5和AaCTLMA15的表达与对照组相比在2天、4天和6天显著性下调,但在8天显著性上调;AaCTL24和AaGNBP3的表达与对照组相比显著性下调。致倦库蚊CqCTL2和CqCTL24的表达与对照组相比分别在6天和8天显著性上调;CqCTL12的表达与对照组相比显著性下调,而CqCTLMA15的表达与对照组相比只在感染后8天显著下调。(3)当用武昌罗索线虫感染蚊虫时,埃及伊蚊AaPGRP-LC和AaPGRP-S1基因的表达与对照组相比在4天显著性下调,AaPGRP-LE和AaPGRP-SC2基因的表达与对照组相比在4天显著性上调但在6天显著性下调。致倦库蚊CqPGRP-LC只在4天时显著下调,CqPGRP-LE除6天时都显著下调。CqPGRP-S1和CqPGRP-S6基因的表达与对照组相比在4天和6天显著性下调。(4)当用武昌罗索线虫感染埃及伊蚊时,AaToll-1A和AaImd基因的表达与对照组相比分别在8天和6天显著上调80-100倍,说明Toll和Imd信号通路都参与埃及伊蚊对武昌罗索线虫的免疫反应。(5)原核重组表达凝集素纯化得到重组AaCTLGA5和CqCTL12蛋白,体外结合实验证明:重组AaCTLGA5和CqCTL12蛋白能够结合武昌罗索线虫幼虫。(6)在果蝇 S2 细胞成功表达了 AaCTLGA5、CqCTL12、AaPGRP-LC 和CqPGRP-LC的胞外域,免疫共沉淀实验证明:AaPGRP-LC与AaCTLGA5、CqPGRP-LC与CqCTL12之间存在互作。
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