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目的: 采用不同量化参数的捻转针刺手法治疗佐剂性关节炎(AA)大鼠的实验研究,通过神经网络技术建立不同定量化参数的捻转手法治疗AA大鼠急性期的量效关系,并且借助现代科学实验技术揭示不同定量化参数的捻转手法治疗急性期AA大鼠的部分效应机制。 方法: 本课题主要分为三大部分。 第一部分实验:为表型指标的观察和记录阶段。在该部分采用大鼠左足掌皮趾下注射完全弗氏佐剂建立佐剂型关节炎(AA)大鼠模型,并在造模后的第1天(造模的当天记为第0天)进行量化参数的捻转针刺手法治疗,穴位选用单侧足三里穴。将77只大鼠随机分为11组并按数字进行编号,每组7只,分别为空白组、模型组、9组量化参数治疗组,其中治疗组根据频率和治疗时间2个参数组合分别为,A1治疗组、A2治疗组、A3治疗组、B1治疗组、B2治疗组、B3治疗组、C1治疗组、C2治疗组、 C3治疗组。造模前以及第1次治疗前和第6次治疗后分别进行表型指标的收集,并且在第6次治疗后处死并收集血清和大鼠踝关节滑膜组织作为标本并保存。第二部分实验:为分子生物学指标检测阶段。针刺治疗6次后,分别在治疗组A,B,C组中选出刺激量依次增大的三组,即在A组中选用A1组,B组中选出B2组,C组中选出C3组,从而进行定量化参数的捻转手法治疗AA大鼠的分子生物学机制研究。主要技术方法和检测指标如下: (1)应用EILSA技术检测血清中IL-1β,IL-6,TNFα炎症细胞因子的表达水平; (2)应用免疫组化法测量踝关节滑膜组织中HSP70蛋白的表达; (3)应用western blot技术分析滑膜组织中ERK、p-ERK、p38MARK、p-p38MARK、JNK、p-JNK蛋白表达的水平,从细胞膜信号传导途径分析不同量化参数的捻转针刺治疗手法急性期AA大鼠的作用机制。 第三部分:不同量化参数的捻转针刺手法治疗急性期AA大鼠的量效关系研究。选取量化的刺激参数作为针刺手法的“量”,选取踝关节体积作为反映AA大鼠治疗效应的行为学指标,选取血清炎症因子IL-1β, IL-6、TNFα作为针刺治疗AA大鼠效应的分子生物学指标,并且选取统计学有意义的指标作为治疗的“效”,从而通过BP神经网络建立定量化的捻转针刺手治疗急性期AA大鼠的“量”和“效”之间的关系。 结果: 1.不同量化参数的捻转手法对AA大鼠急性期炎症的治疗作用 针刺可以减轻急性期AA大鼠的炎症,通过统计踝关节体积以及整体情况观察,其中刺激量大的量化参数的捻转针刺手法(C3组)在缓解AA大鼠炎症反应优于量化捻转参数的低刺激量治疗组以及中刺激量针刺治疗组。 (1)模型组踝关节滑膜组织HE染色显示:空白组未发现明显异常,模型组滑膜细胞增生,滑膜增厚,大量炎症细胞浸润;A1治疗组细胞排列紊乱,可见炎症浸润;B2治疗组部分细胞变形,有炎症细胞浸润现象;C3治疗组见少量炎症细胞浸润。 (2)行为学指标踝关节体积的变化情况: 与模型组比较:不同量化参数的捻转手法治疗组踝关节体积减小,其中量化参数A1组,与模型组比较有显著性差异(P<0.05),量化参数A2组和量化参数C3组与模型组相比有非常显著性差异(P<0.01)。 各治疗组之间比较:量化参数B2组和量化参数C3与量化参数A1组比较具有统计学意义(P<0.05),量化参数C3组与量化参数A1组比较具有非常显著性差异(P<0.01)。 2.不同量化参数的捻转手法对急性期AA大鼠的血清炎症因子IL-1β、IL-6及TNFα的影响 与空白组比较:模型组与空白组比较有显著性统计学意义(P<0.01)。 与模型组比较:针刺治疗C3组IL-1β、IL-6及TNF-α含量明面降低(P<0.01,P<0.01,P<0.05);针刺治疗B2组IL-1β、IL-6及TNF-α含量明显降低(P<0.05,P<0.05,P<0.01);针刺治疗组A1组IL-1β含量明显降低(P<0.05),IL-6及TNF-α含量的差异无统计学意义(P>0.05)。 各治疗组之间相比较:针对不同的炎症因子,其中IL-1β当C3治疗组分别与A1治疗组和B2治疗组之间比较有统计学意义(P<0.05);IL-6和TNF-α各治疗组之间比较无统计学意义。 3.不同量化参数的捻转手法对踝关节滑膜组织的HSP70表达的影响 与空白组比较:模型组HSP70升高,并且具有非常显著性差异(P<0.01); 与模型组比较:量化参数A1组和量化参数B2组并无显著性差异,而量化参数C3组有非常显著性差异(P<0.01)。 各治疗组之间比较:量化参数A1治疗组和量化参数B2组与量化参数C3组比较有显著性差异(P<0.05)。 4.不同量化参数的捻转手法对MAPK信号通路的影响 与空白组比较:模型组p-p38、p-ERK表达均显著增高,p-JNK表达降低;与模型组比较:各治疗组的p-p38、p-JNK、p-ERK降低,但是只有C3治疗组的p-p38 MAPK蛋白表达具有统计学意义(P<0.05),而各治疗组p-JNK、p-ERK蛋白表达无显著性差异(P>0.05),并且各治疗组p38、JNK、ERK总蛋白表达无显著性差异(P>0.05)。 5.量化参数的捻转手法对急性期AA大鼠治疗作用的量效关系研究 不同量化参数的捻转手法对AA大鼠有不同的治疗作用。以踝关节体积V、炎症因子指标IL-1β及IL-6三个效应指标是C3治疗组有较好的效果,肿瘤坏死因子TNF-α是B2组有较好的治疗效应,通过构建BP神经网络模型,应用已知的量化参数和效应指标作为训练数据,建立量化参数与效应指标的可视化图形,并且对未知的量化捻转参数治疗效应进行预测,从而得出不同量化参数治疗急性期AA大鼠的最佳参数区间。 结论: 1.量化参数的捻转针刺手法能明显改善急性期AA大鼠踝关节的炎症程度,量化参数的捻转手法可以减轻AA大鼠的炎症症状,促进急性期炎症的恢复,并且高刺激量的治疗组有较好的疗效。 2.针刺能够降低大鼠血清IL-1β,IL-6、TNFα的含量,从而提示量化参数的捻转针刺手法针刺足三里穴对急性期AA大鼠有一定的治疗作用与降低血清炎症因子的含量有关,并且不同量化参数对炎症因子的降低呈一定的量效关系。 3.AA大鼠炎症反应会刺激大鼠踝关节滑膜组织内HSP70应激性升高,量化捻转手法针刺足三里穴可降低AA大鼠踝关节滑膜组织的HSP70表达,针刺对HSP70表达紊乱状态调整到正常状态,并且对刺激参数必须有一定量的要求。 4.p38MAPK信号通路可能参与了AA大鼠急性期炎症疾病的发生以及发展过程。量化参数的捻转手法可减轻AA大鼠的炎症反应,其治疗机制可能与降低磷酸化p38MAPK蛋白水平有关。 5.不同量化参数的捻转针刺手法对急性期AA大鼠的治疗作用存在一定的量效关系,并且针对不同的指标存在不同的量效关系。