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乳腺癌是我国女性主要的癌症致死原因,随着外科手术、放化疗、靶向治疗及免疫治疗等综合治疗措施的快速发展,乳腺癌的死亡率总体有所下降,但是仍有接近90%的乳腺癌最终死于转移。目前广泛认可的肿瘤的转移模型是“种子和土壤”假说。肿瘤细胞要转移到远处脏器,不仅需要肿瘤细胞的侵袭性,而且需要支持其转移的微环境。肿瘤转移主要有两种经典的模型,一种是线性转移模型:原发肿瘤内部异质性的细胞突变,形成新的克隆在靶器官中累积并存活。另一种是平行转移模型:肿瘤细胞很早就获得转移潜能,即使最初的病变很小或无法检测,肿瘤细胞就已定植入其他远隔组织。这两个模型提示我们内在驱动基因和外在微环境的变化共同促进了肿瘤细胞的转移。转移瘤的形成过程复杂,首先癌细胞侵袭周围组织,然后透过基质穿出肿瘤组织并注入血管或淋巴管内,形成循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells,CTC）部分CTC在循环系统中逃避免疫细胞的识别得以存活,随着血液循环定植在远处脏器,形成转移灶,实现从原发肿瘤部位播散至远处器官组织的过程。目前,虽然针对血行转移开发了药物（例如贝伐珠单抗）并应用于临床实践,但是抗血管药物并没有显著提高乳腺癌的总体生存。因此,临床中不能忽视乳腺癌转移的另一条重要通道——淋巴转移途径。现阶段多数学者认为肿瘤组织可通过自分泌或旁分泌淋巴管生成因子,淋巴管新生需要复杂细胞事件的相互协调,包括淋巴内皮细胞的增殖、出芽、迁移和导管形成。既往认为淋巴管在肿瘤转移中仅仅是被动提供转移通道,然而,近年来临床病理研究表明淋巴管能够主动适应环境变化,有利于肿瘤转移,这些改变就包括淋巴管新生。因此,研究淋巴管新生对癌症转移具有重要的临床价值。NADPH 氧化酶（Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate Oxidase,Nox）能够将电子从NADPH传递到氧分子,然后相互结合形成超氧阴离子O2-,最后转变为过氧化氢。Nox最早发现于中性粒细胞和巨噬细胞,两者细胞中的Nox4触发“氧化爆发”反应,在发生氧化爆发反应的过程中释放巨量活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）,ROS是机体抵抗外来刺激因素干扰的首条防线。但是目前研究者发现Nox还参与癌症的发生和发展,Nox诱导产生的ROS导致氧离子和超氧化物对细胞膜、DNA转录和蛋白质氧化具有破坏作用,这些ROS可能参与恶性肿瘤的发生。Nox4在内皮细胞中表达最丰富,在静脉内皮细胞中发挥促细胞增殖的作用,在人淋巴内皮细胞（Human Lymphatic Endothelial Cells,HLECs）中可能同样发挥促细胞增殖、迁移的作用。通过调节Nox4的表达,减少淋巴管新生从而减少乳腺癌经淋巴系统转移的机会,可能为乳腺癌的治疗提供新的思路。本研究拟探讨乳腺癌淋巴系统变化对乳腺癌转移的价值,以靶向乳腺癌淋巴管新生为切入点,试图破坏乳腺癌转移的途径,抑制乳腺癌的转移。该研究共分为两部分,第一部分首先通过GEO数据库分析乳腺癌组织内淋巴内皮细胞和正常乳腺组织内淋巴内皮细胞的Nox4表达差异,然后收集可手术乳腺癌临床及病理资料,分析Nox4表达与乳腺癌淋巴管密度的关系,初步判断Nox4在乳腺癌转移中的意义。最后利用Kaplan-Meier Plotter数据库探究Nox4表达与乳腺癌的预后关系。第二部分,通过体外实验研究Nox4对HLECs的增殖、迁移及小管形成能力的影响,分析Nox4对胸导管发芽的影响。进一步通过动物体内实验,应用Nox4抑制剂（GKT137831）处理4T1乳腺癌原位皮下移植瘤小鼠,验证Nox4在淋巴管新生及促进乳腺癌转移的作用,试图为乳腺癌治疗提供新的靶点。研究目的1.分析Nox4的表达水平差异与乳腺癌的临床病理特征相关性,试图探讨Nox4与乳腺癌淋巴结转移的关系以及Nox4与乳腺癌的预后关系。2.体外及动物体内实验探究Nox4促进乳腺癌淋巴管新生以及远处转移的机制。研究方法1、乳腺癌组织和正常乳腺组织内HLECs的Nox4表达差异检索 NCBI GEO 数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）,选取乳腺癌组织内部HLECs转录谱数据,登记号为GSE73613。该数据是从正常乳腺组织和原发浸润性乳腺癌组织中提取HLECs,两组各2个标本。首先通过激光捕获显微切割方法分离HLECs,然后通过GPL570平台进行微阵列数据分析。应用R软件（版本3.2.3,https://www.r-project.org/）进行数据挖掘和统计分析。2、分析乳腺癌组织Nox4的表达情况（1）选取就诊于山东省肿瘤医院的可手术乳腺癌患者81例,所有患者均进行手术治疗,术后分析临床病理特征。免疫组织化学检测雌激素受体、孕激素受体、人表皮生长因子受体2、Ki-67、Nox4以及LYVE-1等表达情况。根据染色进行评分,Nox4和LYVE-1在肿瘤组织表达分为高表达和低表组。分析乳腺癌Nox4和淋巴管密度与临床病理特征的相关性。（2）运用卡方检验比较Nox4和LYVE-1在不同临床病理因素中的表达差异,运用spearman相关分析比较Nox4和LYVE-1表达的相关性。3、分析Nox4表达与乳腺癌预后的关系登陆Kaplan-Meier Plotter在线分析工具,通过乳腺癌组织数据库分析Nox4的表达对乳腺癌患者RFS和OS的影响。其中有RFS完整资料的病例为4929例,有OS数据完整资料的病例为1879例。根据系统自动选择最佳的截断值（cut off）分析乳腺癌Nox4对预后影响。4、体外研究Nox4对HLECs增殖、迁移、小管形成以及胸导管发芽的影响（1）慢病毒感染的方法构建Nox4低表达HLECs,qRT-PCR和western blot检测慢病毒感染效率。（2）利用CCK-8检测HLECs的增殖能力,GKT137831不同浓度和不同作用时间分别处理HLECs,观察细胞活性。（3）采用DCFH-DA荧光染料检测细胞内ROS表达,首先GKT137831（Nox4抑制剂）处理HLECs,药物作用24小时,添加DCFH-DA继续孵育细胞,利用激光共聚焦显微镜拍照并用Image J软件检测荧光强度。（4）分别进行细胞划痕实验和侵袭小室（Transwell）实验观察干预后的HLECs迁移能力变化。（5）线粒体膜电位（ΔΨm）检测和流式细胞技术用于检测HLECs的细胞凋亡:HLECs在实验前应用不同浓度的Nox4抑制剂GKT137831预处理,根据JC-1的说明书步骤进行检测,激光共聚焦显微镜观察并拍照。培养HLECs,分别用不同浓度 GKT137831（0、5、10、15μM）处理细胞,Annexin V-FITC 和 PI 处理细胞,在1小时内上机进行流式细胞技术检测。（6）小管形成实验:分别用Nox4 shRNA慢病毒或GKT137831处理HLECs,在基质胶上培养淋巴内皮细胞,12小时后计数小管的形成数目并拍照。（7）胸导管发芽:8μM的GKT137831和/或20ng/ml的重组小鼠VEGF-C加入到含有基质凝胶培养基中。培养淋巴管,7天后用二值图像和sholl analysis插件绘制胸导管边界连续扩张的网格图,并用ImageJ软件分析。提取胸导管RNA和蛋白质,进行RT-PCR及western blot检测Nox4的表达情况。5、动物体内实验研究Nox4对小鼠乳腺癌原位移植瘤增殖及转移的影响建立BALB/c小鼠原位移植瘤模型,每只小鼠2.5×106个4T1细胞,待小鼠状态良好注入原位,饲养小鼠,待其肿瘤体积达到80-100mm3时进行随机,分为两组（每组5只）,每2天给予GKT137831（50mg/kg）或含相同浓度DMSO的生理盐水口服灌胃,共28天。定期测量肿瘤体积。实验结束时,小心取出肿瘤组织、配对的淋巴结和肺脏。采用HE染色、免疫荧光法检测肿瘤引流区淋巴结及肺转移灶情况,并计数各组转移灶数目。免疫荧光法检测Nox4在淋巴管的定位,瘤内和瘤周组织中的血管和淋巴管分布以及转移灶CCR7的表达情况。研究结果1、乳腺癌组织较正常乳腺组织内HLECs高表达Nox4我们为了确定肿瘤内部和乳腺组织内部HLECs之间Nox4的表达差异,检索NCBI GEO数据库GSE73613数据集,并通过R语言进行分析。结果显示乳腺癌组织中HLECs的Nox4 mRNA的表达高于正常乳腺组织（Log2FC=3.14,P＜0.05）。结果提示乳腺癌组织HLECs的Nox4表达可能与乳腺癌侵袭性相关。2、乳腺癌组织中Nox4高表达淋巴结转移增多（1）通过检测81例乳腺癌组织Nox4和LYVE-1表达,结果显示:Nox4高表达49.4%（40/81）,LYVE-1高表达占54.3%（44/81）。组织学分级高、淋巴结阳性的乳腺癌患者Nox4相对高表达。肿块大小＞2cm、淋巴结阳性、ER阴性、PR阴性,HER2过表达及TNBC患者LYVE-1相对高表达。（2）Nox4和LYVE-I在乳腺癌组织中与预后不良指标明显相关。我们通过spearman相关性分析发现Nox4和LYVE-1在乳腺癌组织中呈正相关性。3、Nox4高表达乳腺癌预后不良利用Kaplan-Meier Plotter在线分析软件分析不同表达水平的Nox4对乳腺癌患者RFS和OS的影响。共纳入4929例乳腺癌,Nox4低表达和高表达的中位RFS分别为57月和37月（P＜0.05）。纳入分析的1879例乳腺癌病例,Nox4低表达和高表达中位OS分别为106.8月和66月（P＜0.05）。4、Nox4能够促进HLECs增殖、迁移、抗凋亡、小管形成以及胸导管发芽（1）应用Nox4-shRNA慢病毒和GKT137831处理HLECs,进行CCK-8实验,结果显示Nox4-shRNA和GKT137831均能够抑制HLECs的增殖,并且呈现浓度依赖性。GKT137831抑制HLECs的半数抑制浓度（IC50）是8.5±0.7μM。（2）Nox是ROS的重要来源,应用不同浓度（0、1、10、15μM）的GKT137831处理HLECs 24小时,DCFH-DA检测Nox4对HLECs中ROS的影响,结果发现随着GKT137831浓度的增加ROS减少。（3）20MOI的Nox4-shRNA慢病毒感染细胞和8μM的GKT137831处理细胞,24小时后检测划痕的愈合面积,结果显示:Nox4-shRNA组和GKT137831处理组划痕愈合速率均明显低于对照组。24小时后Transwell检测细胞迁移情况,结果显示在基因沉默组（Nox4-shRNA）和GKT137831处理组穿过小室膜的细胞数明显少于对照组。既往研究已证实VEGF-C能够促进HLECs增殖,即使增加VEGF-C处理细胞,也不能逆转Nox4-shRNA和GKT137831对HLECs的迁移抑制能力。（4）不同浓度（0、1、10、15μM）的GKT137831处理细胞,分别给予VEGF-C（20ng/ml）和DMSO处理细胞24小时。JC-1检测结果显示Nox4引起早期线粒体膜电位下降。后续我们进一步通过Annexin V-FITC试剂进行流式细胞仪检测,结果显示随着GKT137831浓度增加,HLECs的凋亡增加。（5）将HLECs培养在基质胶,分别应用20MOI的Nox4-shRNA慢病毒感染细胞和8μM的GKT137831处理细胞,其中一组均增加VEGF-C（20ng/ml）,另一组仅行Nox4-shRNA或GKT137831处理细胞。结果显示:无论基因沉默组（Nox4-shRNA）还是抑制剂组（GKT137831）处理细胞后,HLECs的成管能力均明显下降,即使增加促进小管形成的生长因子VEGF-C也不能逆转Nox4下调对小管形成的抑制作用。（6）选取2-3个月龄的C57BL/6J小鼠,解剖胸导管,将其剪成碎片置入基质胶中,应用8μM的GKT137831和/或20ng/ml的重组小鼠VEGF-C处理。培养7天结果显示:单用VEGF-C组,胸导管发芽明显增加,而GKT137831组胸导管的发芽明显减少,即使联合VEGF-C也不能增加胸导管的发芽,进一步RT-PCR和western blot检测胸导管Nox4的表达,结果显示:GKT137831处理胸导管后Nox4蛋白的表达减少。5、Nox4通过ERK通路增加CCL21表达促进淋巴管新生细胞实验已经证实Nox4对HLECs有促进增殖、迁移和抗凋亡的作用,后续我们进行了机制探索。不同浓度的GKT137831处理HLECs,western blot检测结果显示,随着 GKT137831 浓度增加 p-ERK、p-AKT、p-JNK、MMP2、CCL21等表达降低,Cleaved-caspase-3表达升高。进一步应用ERK、AKT、JNK的抑制剂（U0126、AKT inhibitor Ⅷ 和 SP600125）以及 ROS 抑制剂（NAC）处理HLECs,结果显示NAC处理组和U0126处理组小管形成能力受到抑制,AKT inhibitor Ⅷ和SP600125处理组,HLECs的成管能力无明显变化。培养HLECs,应用20MOI的慢病毒感染细胞使其过表达Nox4,24小时后给予不同浓度的U0126（5、10、15μM）处理细胞,结束后进行蛋白免疫印迹技术检测显示,随着抑制剂浓度的增加p-ERK表达量逐渐下降,伴随着CCL21蛋白表达量降低。6、Nox4促进小鼠乳腺癌原位移植瘤的淋巴管新生和转移采用高度侵袭性4T1细胞,建立BALB/c小鼠原位移植瘤模型,分别给予小鼠GKT137831（50mg/kg）和GKT137831溶剂DMSO 口服灌胃。结果显示小鼠移植瘤大小及瘤重无明显差异。GKT137831处理小鼠,移植瘤Nox4表达降低。对移植瘤进行免疫荧光共定位检测结果显示:无论实验组还是对照组均可发现肿瘤组织内的Nox4和淋巴管内皮标志物LYVE-1共定位,提示淋巴管内皮细胞表达Nox4,间接提示调节Nox4表达可能影响淋巴管的新生。GKT137831处理小鼠,无论实验组还是对照组肿瘤内部和肿瘤周围的血管数目均无明显的差异,而GKT137831处理组肿瘤周围淋巴管受到抑制,肿瘤内部淋巴管无明显变化。小鼠原位移植瘤模型的淋巴结和肺脏HE染色结果显示GKT137831处理小鼠后,淋巴结转移病灶数目和肺部转移病灶数目均明显减少。前期研究发现,Nox4能够促进HLECs的CCL21表达,既往研究已经证实CCL21的配体是CCR7,因此我们对小鼠移植瘤组织和转移灶组织进行CCR7检测,免疫荧光检测显示:移植瘤组织CCR7呈高表达,淋巴结和肺部转移灶组织内CCR7也呈高表达。研究结论1、乳腺癌组织Nox4高表达能够促进淋巴管新生和淋巴结转移,乳腺癌Nox4高表达预后较Nox4低表达的患者差。2、乳腺癌Nox4表达可能通过ROS/ERK/CCL21通路增加肿瘤周围淋巴管产生,吸引CCR7阳性的乳腺癌细胞进入淋巴管发生乳腺癌的淋巴转移和远处转移。