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背景：相较于传统的大细胞量转录组测序方式，单细胞转录组测序技术提供了新的研究维度并在发育、生理、疾病等领域的研究应用广泛。由于哺乳动物单个细胞内RNA总量微少，目前所有单细胞转录组测序技术在建库时均需在RNA逆转录生成cDNA后进行预扩增，这不可避免会产生扩增偏差。在全长转录本测序中，扩增偏差会造成转录本不能被均匀覆盖，造成后续分析如转录本丰度定量、RNA剪接变体、长链非编码RNA识别等不准确。
人类基因组中大约有20%的基因反义链上有转录情况出现，因此获得RNA转录的原始链信息对于准确定量转录本丰度、识别反义链转录本等十分关键。而目前所有的单细胞全长转录本测序技术都丢失了RNA原始链信息，且绝大多数技术的测序对象是mRNA，因此单细胞内总RNA携带信息的探索还很有限。SmallRNA在各种生命进程中起到了关键的调节作用，然而目前单细胞smallRNA的测序技术发展缓慢，且单个细胞中对完整的smallRNA组和mRNA组进行同时观测的技术还没有实现。
结果：针对以上不足，我们开发了一种无扩增偏差的单细胞总RNA链特异性全长转录本及单细胞smallRNA-mRNA双转录组测序技术——全息法单细胞转录组测序技术(全息法，Holo-Seq)以及对应数据的分析方法。全息法通过在建库初始引入已知序列的carrierRNA，与单个细胞总RNA或smallRNA共同达到大细胞量RNA-Seq的最低建库起始RNA量，接着进行常规RNA-Seq建库，并在测序扩增步骤前酶切去除carrierRNA的逆转录产物，使得测序结果不受carrierRNA影响。全息法单细胞总RNA(链特异性)测序建库中没有cDNA扩增步骤故避免了扩增偏差干扰，成功探测到poly(A-)RNA和poly(A+)RNA并实现全长转录本丰度准确定量和全长均匀覆盖，且具备较高的转录本探测灵敏度。使用总RNA链特异性数据成功识别已知和未知的反义链转录本，并发现其在细胞间表达量异质性高于编码基因。同时对总RNA全长转录本测序可计算获得pre-mRNA丰度，进而可推测RNA的代谢动态。全息法可与捕获技术结合进行目标基因转录本测序，降低测序成本，在本研究中其与外显子捕获技术成功结合并达到20倍富集程度。将全息法RNA链特异性测序应用于小鼠小胶质单细胞，成功将处于免疫激活状态和神经元监控状态的两群小胶质细胞区分开来。此外，全息法成功对单细胞内的smallRNA进行探测和精准定量，且作为首个对单个细胞内smallRNA和poly(A+)RNA同时测序观测的scRNA-seq技术，成功查找到表达量负相关的miRNA-mRNA互作对，实现单细胞水平上miRNA-mRNA调控关系的研究，并通过观测受SE调控的mRNA和miRNA丰度在单细胞基因组水平上对超级增强子活性进行探索。同时，针对全息法的数据特点开发了一系列分析方法，完成了总RNA全长转录本覆盖度的分长度段比较、单细胞数据查找反义链转录本、smallRNA信息的准确获取、单细胞miRNA-mRNA的联合模块分析以及全基因组范围内观测超级增强子活性等工作。
人类基因组中大约有20%的基因反义链上有转录情况出现，因此获得RNA转录的原始链信息对于准确定量转录本丰度、识别反义链转录本等十分关键。而目前所有的单细胞全长转录本测序技术都丢失了RNA原始链信息，且绝大多数技术的测序对象是mRNA，因此单细胞内总RNA携带信息的探索还很有限。SmallRNA在各种生命进程中起到了关键的调节作用，然而目前单细胞smallRNA的测序技术发展缓慢，且单个细胞中对完整的smallRNA组和mRNA组进行同时观测的技术还没有实现。
结果：针对以上不足，我们开发了一种无扩增偏差的单细胞总RNA链特异性全长转录本及单细胞smallRNA-mRNA双转录组测序技术——全息法单细胞转录组测序技术(全息法，Holo-Seq)以及对应数据的分析方法。全息法通过在建库初始引入已知序列的carrierRNA，与单个细胞总RNA或smallRNA共同达到大细胞量RNA-Seq的最低建库起始RNA量，接着进行常规RNA-Seq建库，并在测序扩增步骤前酶切去除carrierRNA的逆转录产物，使得测序结果不受carrierRNA影响。全息法单细胞总RNA(链特异性)测序建库中没有cDNA扩增步骤故避免了扩增偏差干扰，成功探测到poly(A-)RNA和poly(A+)RNA并实现全长转录本丰度准确定量和全长均匀覆盖，且具备较高的转录本探测灵敏度。使用总RNA链特异性数据成功识别已知和未知的反义链转录本，并发现其在细胞间表达量异质性高于编码基因。同时对总RNA全长转录本测序可计算获得pre-mRNA丰度，进而可推测RNA的代谢动态。全息法可与捕获技术结合进行目标基因转录本测序，降低测序成本，在本研究中其与外显子捕获技术成功结合并达到20倍富集程度。将全息法RNA链特异性测序应用于小鼠小胶质单细胞，成功将处于免疫激活状态和神经元监控状态的两群小胶质细胞区分开来。此外，全息法成功对单细胞内的smallRNA进行探测和精准定量，且作为首个对单个细胞内smallRNA和poly(A+)RNA同时测序观测的scRNA-seq技术，成功查找到表达量负相关的miRNA-mRNA互作对，实现单细胞水平上miRNA-mRNA调控关系的研究，并通过观测受SE调控的mRNA和miRNA丰度在单细胞基因组水平上对超级增强子活性进行探索。同时，针对全息法的数据特点开发了一系列分析方法，完成了总RNA全长转录本覆盖度的分长度段比较、单细胞数据查找反义链转录本、smallRNA信息的准确获取、单细胞miRNA-mRNA的联合模块分析以及全基因组范围内观测超级增强子活性等工作。