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分枝核酸内切酶-1(FEN1)是一种结构特异性的多功能核酸酶。FEN1具有分枝内切核酸酶(FEN)，5核酸外切酶(EXO)和缺口内切核酸酶(GEN)的活性。GEN活性在凋亡DNA片段化和加工同源重组产物中起着至关重要的作用。之前的研究表明FEN1在DNA复制和修复过程中发生不同的种类的翻译后修饰，例如甲基化，磷酸化和SUMO-1修饰。FEN1通常在S期早期被PRMT5甲基化，此时β-pin区域(L194-K200)发生构象变化抑制FEN1磷酸化，从而增强其FEN1与PCNA的相互作用。此外，WDR4与FEN1/PCNA复合物的相互作用可抑制GEN活性并促进FEN活性以除去分枝。去除RNA引物后，FEN1被去甲基化，再被磷酸化，使其从PCNA上解离，经历依赖泛素化降解或其他DNA修复过程。当细胞遭受内源性或外源性DNA损伤(例如紫外线照射或氧化应激)时，FEN1会被磷酸化。磷酸化的FEN1会刺激其自身的SUMO-1修饰，以促进其与DNA修复蛋白(如Rad9-Rad1-Hus1复合物)的相互作用，以抵消DNA复制的压力。最近的研究报道，赖氨酸琥珀酰化是原核生物和真核生物中的常见修饰。FEN1的乙酰化修饰和琥珀酰化修饰可能参与了细胞代谢和DNA损伤修复。研究表明，紫外线刺激细胞中FEN1的乙酰化修饰水平上调，而当FEN1在体外被p300乙酰化时，其DNA结合和酶切活性降低30。FEN1乙酰化修饰参与DNA损伤修复的机制尚不明确。此外，科学家研究发现，赖氨酸琥珀酰化是原核生物和真核生物中的常见修饰，不仅线粒体中的代谢蛋白，而且核DNA复制和修复相关蛋白都可以被琥珀酰化，其中包括FEN1。目前对于蛋白质琥珀酰化修饰的研究十分有限，尚不清楚琥珀酰化修饰的生物学意义。因此，FEN1的酰基化修饰的生物学意义尚未清晰。有趣的是，科学家通过质谱检测鉴定发现FEN1乙酰化和琥珀酰化位点之一——K200位于其β-pin区域，而晶体衍射数据表明该区域参与了FEN1的磷酸化调节。因此，本论文希望通过分子生物学、生物化学、结构生物学以及细胞生物学等方法，探究FEN1β-pin区域的K200位点琥珀酰化和乙酰化修饰是否参与到DNA复制和损伤修复过程当中，以及这两种修饰在维持基因组稳定性中的可能作用机制。具体结论如下：
1)发现了FEN1的琥珀酰化修饰可以响应各种类型的DNA损伤胁迫。在生理情况下，FEN1的琥珀酰化修饰水平在G1期维持较高水平，在S期则明显降低，但当细胞在S期受到DNA损伤胁迫(HU，MMC，CPT，UV)时，琥珀酰化水平会显著上调。相较而言，FEN1的乙酰化修饰水平仅在UV处理时会出现升高。表明FEN1琥珀酰化和乙酰化在响应不同DNA损伤胁迫时可能存在差异作用。
2)通过干扰或模拟甲基化、磷酸化和SUMO-1修饰，探究了FEN1琥珀酰化和乙酰化修饰与其他修复相关修饰之间的关系。结果发现，FEN1甲基化修饰与琥珀酰化修饰相互抑制，而FEN1磷酸化促进琥珀酰化修饰与乙酰化修饰。因此，为响应DNA损伤，FEN1发生去甲基化和磷酸化，从而上调FEN1琥珀酰化和乙酰化修饰水平。
3)我们验证了K200是位于β-pin区域的重要琥珀酰化和乙酰化修饰位点。研究发现K200位点琥珀酰化修饰水平在G1期较高，在S期几乎完全消失。K200位点乙酰化水平在G1期和S期均相对平稳。此外，K200位点琥珀酰化和乙酰化修饰水平在细胞受到DNA损伤胁迫状态下都会明显升高。
4)我们将200位点赖氨酸突变为丙氨酸(A)模拟乙酰化，或突变为谷氨酸(E)模拟琥珀酰化研究FEN1琥珀酰化和乙酰化修饰水平变化对其蛋白活性和互作蛋白结合能力的影响。发现K200E模拟琥珀酰化会抑制FEN1与PCNA的结合，而K200A模拟乙酰化对PCNA的结合没有影响。通过细胞裂解液GEN活性的测定，我们发现FEN1K200E模拟琥珀酰化显著增强GEN活性，而K200A模拟乙酰化显著降低GEN活性。
5)通过研究FEN1WT、K200A和K200E在细胞内的相关修饰水平和蛋白互作水平，分析了FEN1琥珀酰化和乙酰化在损伤响应中的区别。在生理条件和损伤胁迫情况下，FEN1K200E模拟琥珀酰化提高SUMO-1修饰水平，从而增强与Rad1、Hus1的互作，而K200A模拟乙酰化降低SUMO-1修饰水平，减弱与Rad1、Hus1的互作。
6)经过损伤标志物的量化及细胞存活率的测定，发现在生理情况下和损伤胁迫情况下，K200A细胞内γH2AX水平显著高于WT，而K200E细胞内γH2AX水平与WT类似。由于FEN1K200A模拟乙酰化导致细胞内损伤积累，造成细胞存活率下降，而K200E模拟琥珀酰化不会累积损伤，细胞存活率与WT相似。
综上，我们研究发现FEN1β-pin区域的酰基化修饰对细胞响应DNA损伤胁迫具有重要作用，且K200的琥珀酰化修饰和乙酰化修饰在调控FEN1蛋白功能中存在差异。
1)发现了FEN1的琥珀酰化修饰可以响应各种类型的DNA损伤胁迫。在生理情况下，FEN1的琥珀酰化修饰水平在G1期维持较高水平，在S期则明显降低，但当细胞在S期受到DNA损伤胁迫(HU，MMC，CPT，UV)时，琥珀酰化水平会显著上调。相较而言，FEN1的乙酰化修饰水平仅在UV处理时会出现升高。表明FEN1琥珀酰化和乙酰化在响应不同DNA损伤胁迫时可能存在差异作用。
2)通过干扰或模拟甲基化、磷酸化和SUMO-1修饰，探究了FEN1琥珀酰化和乙酰化修饰与其他修复相关修饰之间的关系。结果发现，FEN1甲基化修饰与琥珀酰化修饰相互抑制，而FEN1磷酸化促进琥珀酰化修饰与乙酰化修饰。因此，为响应DNA损伤，FEN1发生去甲基化和磷酸化，从而上调FEN1琥珀酰化和乙酰化修饰水平。
3)我们验证了K200是位于β-pin区域的重要琥珀酰化和乙酰化修饰位点。研究发现K200位点琥珀酰化修饰水平在G1期较高，在S期几乎完全消失。K200位点乙酰化水平在G1期和S期均相对平稳。此外，K200位点琥珀酰化和乙酰化修饰水平在细胞受到DNA损伤胁迫状态下都会明显升高。
4)我们将200位点赖氨酸突变为丙氨酸(A)模拟乙酰化，或突变为谷氨酸(E)模拟琥珀酰化研究FEN1琥珀酰化和乙酰化修饰水平变化对其蛋白活性和互作蛋白结合能力的影响。发现K200E模拟琥珀酰化会抑制FEN1与PCNA的结合，而K200A模拟乙酰化对PCNA的结合没有影响。通过细胞裂解液GEN活性的测定，我们发现FEN1K200E模拟琥珀酰化显著增强GEN活性，而K200A模拟乙酰化显著降低GEN活性。
5)通过研究FEN1WT、K200A和K200E在细胞内的相关修饰水平和蛋白互作水平，分析了FEN1琥珀酰化和乙酰化在损伤响应中的区别。在生理条件和损伤胁迫情况下，FEN1K200E模拟琥珀酰化提高SUMO-1修饰水平，从而增强与Rad1、Hus1的互作，而K200A模拟乙酰化降低SUMO-1修饰水平，减弱与Rad1、Hus1的互作。
6)经过损伤标志物的量化及细胞存活率的测定，发现在生理情况下和损伤胁迫情况下，K200A细胞内γH2AX水平显著高于WT，而K200E细胞内γH2AX水平与WT类似。由于FEN1K200A模拟乙酰化导致细胞内损伤积累，造成细胞存活率下降，而K200E模拟琥珀酰化不会累积损伤，细胞存活率与WT相似。
综上，我们研究发现FEN1β-pin区域的酰基化修饰对细胞响应DNA损伤胁迫具有重要作用，且K200的琥珀酰化修饰和乙酰化修饰在调控FEN1蛋白功能中存在差异。