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细胞分化是一个复杂的生物过程，也一直是科学研究的热点问题。干细胞分化调控机制的研究可以为再生医学、发育缺陷治疗以及药物筛选等提供良好的理论支持。近年来，关于干细胞的研究越来越多，特别是诱导多能干细胞的出现使相关领域经历了巨大变革，而关于分化进程的调控机制仍存在着诸多未解之谜。
在生物体内，岩藻糖基转移酶(fucosyltransferase)将岩藻糖供体(GDP-fucose)链接到蛋白N-糖链末端或氨基酸(丝氨酸或苏氨酸)残基上。越来越多的研究表明，岩藻糖基化在疾病发生、细胞分化、细胞间识别通讯等方面发挥着越来越重要的作用。例如，血型疾病、炎症和肿瘤的发生总会伴随着岩藻糖基化的急剧上升或下降。岩藻糖基化缺陷的小鼠表现出存活率低、发育不完全等缺陷。
本文主要介绍岩藻糖基化在小鼠胚胎干细胞E14.1分化过程中发挥的作用以及分化过程中岩藻糖基化差异蛋白分离鉴定方法的建立。首先，我们对维甲酸(RA)诱导小鼠胚胎干细胞分化作用进行了验证。其次，我们利用岩藻糖类似物—6-叠氮岩藻糖(6-azide-Fuc)和凝集素，对细胞分化过程中岩藻糖基化的变化趋势进行了检测。实验发现，在RA诱导小鼠胚胎干细胞(E14.1)分化过程中，岩藻糖基化呈现先上升后下降的变化趋势。岩藻糖基化相关酶同样在分化过程中发生变化。我们发现，岩藻糖基转移酶mFUT8以及岩藻糖供体合成相关酶岩藻糖合成酶(FX)、岩藻糖焦磷酸化酶(FPGT)的敲低，会导致小鼠胚胎干细胞E14.1在RNA水平上出现初步分化趋势，而细胞表型以及碱性磷酸酶(AP)染色检测结果显示细胞并未发生分化，表明单独抑制岩藻糖基化水平仅能影响部分基因转录，但无法诱导小鼠胚胎干细胞细胞发生分化。接着，我们进行了岩藻糖基化相关酶敲低的诱导分化实验。蛋白质印迹(WB)结果表明单独敲低相关酶，并不会改变干性因子蛋白水平，而抑制细胞岩藻糖基化水平可以加速小鼠胚胎干细胞RA诱导分化进程，且加速幅度与岩藻糖基化抑制水平相关，敲低从头合成关键酶FX对细胞岩藻糖基化水平抑制最大，能够最大幅度的加速细胞分化进程。上述结果表明，岩藻糖基化确实能够影响细胞干性状态，调控细胞分化进程。
接下来，我们建立了一个分离鉴定分化过程中岩藻糖基化差异蛋白的方法，我们给细胞喂养6-azide-Fuc进行代谢标记，然后添加RA进行诱导分化，分别收集RA诱导0天、2天的细胞分成两组，裂解得到蛋白，通过点击化学与带有炔烃的生物素进行偶联，然后用链霉亲合素微珠特异性结合糖基化蛋白，使用胰酶水解成肽段。收集上清液分别加入甲醛、氰基硼氢化钠与氘代甲醛、氰基硼氘化钠进行二甲基标记，然后混合成一管进行冻干，质谱分析。根据质谱结果，筛选出分化前后差异蛋白锌指核仁蛋白(LYAR)和DNA转录结合因子(Rb1cc1)。其中LYAR在维持胚胎干细胞稳态中具有重要作用。而Rb1cc1在心脏发育、肌肉分化等过程中发挥作用。
综上，本课题将岩藻糖基化与干细胞分化联系在一起，为细胞分化调控提供了新的研究方向，为细胞分化过程中关键性岩藻糖基化蛋白的分离鉴定提供了新的方法。
在生物体内，岩藻糖基转移酶(fucosyltransferase)将岩藻糖供体(GDP-fucose)链接到蛋白N-糖链末端或氨基酸(丝氨酸或苏氨酸)残基上。越来越多的研究表明，岩藻糖基化在疾病发生、细胞分化、细胞间识别通讯等方面发挥着越来越重要的作用。例如，血型疾病、炎症和肿瘤的发生总会伴随着岩藻糖基化的急剧上升或下降。岩藻糖基化缺陷的小鼠表现出存活率低、发育不完全等缺陷。
本文主要介绍岩藻糖基化在小鼠胚胎干细胞E14.1分化过程中发挥的作用以及分化过程中岩藻糖基化差异蛋白分离鉴定方法的建立。首先，我们对维甲酸(RA)诱导小鼠胚胎干细胞分化作用进行了验证。其次，我们利用岩藻糖类似物—6-叠氮岩藻糖(6-azide-Fuc)和凝集素，对细胞分化过程中岩藻糖基化的变化趋势进行了检测。实验发现，在RA诱导小鼠胚胎干细胞(E14.1)分化过程中，岩藻糖基化呈现先上升后下降的变化趋势。岩藻糖基化相关酶同样在分化过程中发生变化。我们发现，岩藻糖基转移酶mFUT8以及岩藻糖供体合成相关酶岩藻糖合成酶(FX)、岩藻糖焦磷酸化酶(FPGT)的敲低，会导致小鼠胚胎干细胞E14.1在RNA水平上出现初步分化趋势，而细胞表型以及碱性磷酸酶(AP)染色检测结果显示细胞并未发生分化，表明单独抑制岩藻糖基化水平仅能影响部分基因转录，但无法诱导小鼠胚胎干细胞细胞发生分化。接着，我们进行了岩藻糖基化相关酶敲低的诱导分化实验。蛋白质印迹(WB)结果表明单独敲低相关酶，并不会改变干性因子蛋白水平，而抑制细胞岩藻糖基化水平可以加速小鼠胚胎干细胞RA诱导分化进程，且加速幅度与岩藻糖基化抑制水平相关，敲低从头合成关键酶FX对细胞岩藻糖基化水平抑制最大，能够最大幅度的加速细胞分化进程。上述结果表明，岩藻糖基化确实能够影响细胞干性状态，调控细胞分化进程。
接下来，我们建立了一个分离鉴定分化过程中岩藻糖基化差异蛋白的方法，我们给细胞喂养6-azide-Fuc进行代谢标记，然后添加RA进行诱导分化，分别收集RA诱导0天、2天的细胞分成两组，裂解得到蛋白，通过点击化学与带有炔烃的生物素进行偶联，然后用链霉亲合素微珠特异性结合糖基化蛋白，使用胰酶水解成肽段。收集上清液分别加入甲醛、氰基硼氢化钠与氘代甲醛、氰基硼氘化钠进行二甲基标记，然后混合成一管进行冻干，质谱分析。根据质谱结果，筛选出分化前后差异蛋白锌指核仁蛋白(LYAR)和DNA转录结合因子(Rb1cc1)。其中LYAR在维持胚胎干细胞稳态中具有重要作用。而Rb1cc1在心脏发育、肌肉分化等过程中发挥作用。
综上，本课题将岩藻糖基化与干细胞分化联系在一起，为细胞分化调控提供了新的研究方向，为细胞分化过程中关键性岩藻糖基化蛋白的分离鉴定提供了新的方法。